武江，李森，李子瑜，武丹陽

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷030801）

黃花菜（Hemerocallis citrinaBarni）又名金針菜、忘憂草，屬藥食同源的觀賞植物［1］。黃花菜在我國栽培歷史悠久，廣泛分布于湖南、甘肅、山西和陜西等地［2］，由于其經(jīng)濟(jì)價值可觀，現(xiàn)成為多地區(qū)農(nóng)民增收和調(diào)整種植結(jié)構(gòu)的優(yōu)選栽培作物［3］。但是，由于黃花菜為多年生草本植物，雜交育種周期長，且生產(chǎn)中大多采用分株等無性繁殖方式，育種進(jìn)展緩慢，急需通過分子育種的手段加速育種進(jìn)程，培育新優(yōu)高產(chǎn)品種。細(xì)胞學(xué)圖譜、遺傳連鎖圖譜、物理圖譜及全基因組序列等遺傳學(xué)研究平臺的建立可促進(jìn)黃花菜功能基因和分子遺傳育種方面的研究。

熒光原位雜交（FISH）技術(shù)主要用于解答染色體和基因組水平的結(jié)構(gòu)變化、變異以及進(jìn)化問題［4］。該技術(shù)將目的基因片段定位于動植物細(xì)胞的中期和減數(shù)分裂粗線期染色體上，是細(xì)胞遺傳學(xué)和基因組學(xué)研究的重要手段之一。將FISH應(yīng)用于構(gòu)建物種的染色體細(xì)胞遺傳圖譜，對提升基因組組裝質(zhì)量起著重要的輔助作用［5］。目前在許多作物中基于高分辨率FISH構(gòu)建的物理圖譜已有報道，如玉米［6］、白菜［7］、黃瓜［8］、番茄［9］、棉花［10］、土豆［11］、木瓜［12］等，為確定分子標(biāo)記在染色體上的物理位置、基因組測序與組裝提供了準(zhǔn)確信息。

由于園藝植物進(jìn)化和馴化歷史悠久，通常具有較高的雜合率和倍性［14］。前期研究工作發(fā)現(xiàn)，黃花菜同樣具有大染色體、大基因組［15］且遺傳背景復(fù)雜等生物學(xué)特性。目前，課題組已構(gòu)建黃花菜的種內(nèi)和種間2張細(xì)胞遺傳圖譜，通過展現(xiàn)遺傳標(biāo)記在染色體上的實(shí)際距離，可為基因組測序及序列裝配提供重要基礎(chǔ)資源。如何實(shí)現(xiàn)黃花菜的遺傳圖譜與物理圖譜的整合，成為一個亟待解決的技術(shù)難題。要攻破這一難題，首先要解決黃花菜熒光原位雜交體系的構(gòu)建，本研究將為黃花菜細(xì)胞遺傳學(xué)研究和基因組研究的深入開展提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大同黃花菜（H.cv.‘DatongHuanghua’）栽培于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站。選擇天氣晴朗、陽光充足的情況，于上午8：00-10：00進(jìn)行取樣。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 根尖細(xì)胞中期染色體切片制備

將整株植物挖出栽種于溫室沙床上促進(jìn)其側(cè)根生長，夏季時約7 d之后，其它季節(jié)約14 d之后，可獲得幼嫩且健壯的根尖。將根尖剪下裝入預(yù)冷蒸餾水的玻璃瓶中，置于冰盒內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。

（1）預(yù)處理

將材料浸泡于濃度為2.9μg·mL-1八羥基喹啉溶液中，于4℃黑暗條件下分別處理2 h、3 h、4 h和5 h。

（2）固定與保存

將材料移入新鮮配置的卡諾氏固定液中，4℃條件下固定24 h以上。若長期保存則轉(zhuǎn)入?20℃溫度下70%酒精溶液中。

（3）酶解

經(jīng)過固定處理的材料放入4%纖維素酶和2%果膠酶混合液中37℃條件下酶解。果膠酶購自Japan Yakult公司（日本，京都），纖維素酶購自Sigma公司（美國，圣克拉拉）。設(shè)置酶解時間梯度為140 min、150 min、160 min和170 min。

（4）制片

火焰干燥法參照高和瓊等［16］報道的方法。將材料放于干凈的載玻片中央，鑷子敲至漿狀，滴加卡諾固定液使材料分散。將載玻片置于酒精燈上迅速烘烤后，于空氣中晾干待用。

（5）鏡檢拍照

使用相差顯微鏡Nikon BX41于20倍鏡下檢測和拍照，質(zhì)量合格切片放入?20℃冰箱中用于待用。

1.2.2 花粉母細(xì)胞粗線期染色體切片制備

在現(xiàn)蕾期選取2～3 mm，4～5 mm，6～7 mm不同齡段的幼嫩花蕾為試驗(yàn)材料。

（1）固定與保存

將材料移入卡諾固定液于4℃條件下處理24 h。后將固定液換成70%乙醇，置于?20℃條件下長期保存?zhèn)溆?，并定期更換70%乙醇。

（2）粗檢

使用解剖針剝?nèi)セㄝ唷⒒ò?，?、4個花藥置于載玻片，加一滴卡寶品紅，用鑷子壓碎花藥，加蓋玻片后使用普通光學(xué)顯微鏡Olymbus CX33于20倍下進(jìn)行鏡檢和拍照。

（3）酶解

將材料放入4%纖維素酶和2%果膠酶混合液中37℃條件下酶解180 min、200 min、220 min、240 min，酶解過程中每隔一段時間輕彈離心管，盡可能使花粉粒酶解均勻。

（4）制片

傳統(tǒng)火焰干燥法：取多個花藥于載玻片上，同根尖制片步驟獲得制片。

改良火焰干燥法：花藥敲碎去雜后向載玻片加1滴乙酸，放置于50℃攤片機(jī)上干燥，期間用鑷子不停撥動。1～2 min后加2滴60%酒精，酒精燈火焰干燥制片。

（5）鏡檢拍照及儲存方法如根尖制片中步驟。

1.2.3 熒光原位雜交體系的建立

擬南芥45S rDNA和5S rDNA探針序列由江蘇師范大學(xué)韓永華教授惠贈。使用直接標(biāo)記法由生工生物工程有限公司合成探針。

熒光原位雜交技術(shù)參數(shù)的篩選：

（1）載玻片的處理

使用2種載玻片進(jìn)行對比：將載玻片浸泡于鉻酸洗液（5%重鉻酸鉀濃硫酸溶液）中24 h以上，取出清洗后置于無水乙醇中浸泡4 h，晾干備用；使用新的載玻片直接用于染色體制片。

（2）烘片

本試驗(yàn)設(shè)計了50℃、60℃2個溫度，烘片時間分別為0.5 h、1.0 h、1.5 h和2.0 h。

（3）染色體標(biāo)本的變性溫度和時間

設(shè)定60℃、70℃、80℃和90℃4個溫度梯度，時間設(shè)定1、2、3和4 min 4個處理。

（4）雜交后洗脫強(qiáng)度的篩選

將雜交后的載玻片放入1×TNT（10 mmol·L-1Tris-HCl；150 mmol·L-1NaCl；0.5%Tween20；pH=7.8～8.2）中置于搖床上70 r·min-1洗脫3次，每次5 min，在第二步的洗脫過程中設(shè)置洗脫溫度為：室溫、37℃、42℃3個梯度。

熒光原位雜交及信號檢測的方法參照HAN等人報道的方法［17］，具體步驟如下：

（1）烘片

將玻片置于60℃烘箱中處理1.5 h。

（2）變性

玻片滴加100μL 70%FAD變性液，蓋上蓋玻片，80℃變性2 min。

（3）脫水

揭掉玻片，立即放入?20℃預(yù)冷的70%、95%、100%梯度酒精溶液中各脫水5 min。

（4）取出切片，室溫下空氣干燥。

（5）雜交

將20 mL雜交液滴加到玻片上，蓋上蓋玻片，放入雜交盒中37℃條件下過夜（雜交液體系：FAD10μL、20×SSC（3 mol·L-1NaCl；0.3 mol·L-1檸檬酸鈉；pH=7.0）2μL、ssDNA 2μL、45S rDNA 1μL、5S rDNA 1μL、50%硫酸葡聚糖4μL）。

（6）洗脫

將雜交后的玻片放入1×TNT中置于搖床上70 r·min-1洗脫3次，每次5 min，其中二級洗脫在37℃條件下洗脫，其余在室溫條件下洗脫。

（7）復(fù)染

切片在室溫黑暗條件下晾干，每張切片加20 μL 2μg·mL-1的DAPI（含10%VectaShield）復(fù)染。

（8）信號檢測和拍照

在熒光顯微鏡（LEICA DM6 B）下使用紫外、藍(lán)光和綠光激發(fā)濾光塊組合分別觀察檢測染色體上的紅色和綠色探針雜交信號，使用冷式數(shù)位機(jī)（CCD）攝相頭拍攝記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 根尖中期細(xì)胞染色體制片結(jié)果

2.1.1 不同預(yù)處理?xiàng)l件篩選結(jié)果

預(yù)處理的目的在于阻斷細(xì)胞分裂時紡錘體微管的形成，積累更多的中期分裂相，同時使染色體進(jìn)一步凝縮，在后期易于得到良好制片。結(jié)果表明，八羥基喹啉溶液處理4 h時染色體形態(tài)清晰、凝縮程度適宜、利于染色體分散（圖1B）。預(yù)處理時間低于4 h時，染色體較長，易纏繞，制片效果差（圖1A）；預(yù)處理時間5 h時，染色體凝縮過度，難以區(qū)分非同源染色體間的形態(tài)特征，同時也不利于探針與靶位點(diǎn)的結(jié)合（圖1C）。

圖1 不同預(yù)處理?xiàng)l件下染色體凝縮情況Fig.1 Chromosomes condensation at different preprocessing condition

2.1.2 不同酶解時間篩選結(jié)果

經(jīng)過酶液處理，可以去除植物細(xì)胞壁對染色體的束縛，同時避免濃厚細(xì)胞質(zhì)的影響，利于染色體分散。結(jié)果表明，酶解160 min時，染色體分散度好，背景清晰無干擾（圖2C）。酶解低于160 min時，酶解不充分，有細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)殘留（圖2A）；酶解高于160 min時，染色體遭到不同程度的破壞，無法得到良好制片（圖2B）。黃花菜根尖中期染色體制片篩選出的最佳體系為2.9μg·mL-1濃度的八羥基喹啉溶液處理4 h，混合酶液（纖維素酶∶果膠酶=2∶1）37℃酶解160 min。

2.2 花粉母細(xì)胞粗線期染色體制片結(jié)果

2.2.1 不同齡段花蕾篩選結(jié)果

圖2 不同酶解時間下染色體情況Fig.2 Chromosomes on different enzymolysis time

在花蕾發(fā)育早期，通過采集不同長度花蕾并觀察花藥內(nèi)花粉母細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)特征，以確定花粉母細(xì)胞集中在粗線期時對應(yīng)的花蕾長度。由圖3可以得出，花蕾處于2～3 mm齡段時，花藥內(nèi)花粉母細(xì)胞多處于分裂間期和減數(shù)分裂細(xì)線期（圖3B）?；ɡ偬幱?～5 mm齡段時，花粉母細(xì)胞多處于粗線期或粗線期之前（圖3C），此時細(xì)胞內(nèi)核仁明顯，與細(xì)線期相比，由于同源染色體聯(lián)會二價體開始收縮變粗并相互纏繞，適合作為花粉母細(xì)胞粗線期染色體制片材料。當(dāng)花蕾生長至4～5 mm時，花粉母細(xì)胞大多已進(jìn)入減數(shù)分裂Ⅰ中期和后期（圖3D）。超過6 mm的花蕾，花粉母細(xì)胞已進(jìn)入四分體時期甚至發(fā)育成花粉粒。

圖3 花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂不同時期細(xì)胞學(xué)特征Fig.3 Cytological characteristics of pollen mother cells at different stages of meiosis

2.2.2 不同酶解時間篩選結(jié)果

如圖4所示，在酶解220 min左右時，染色體分散度良好，染色質(zhì)濃度低且背景較為清晰，易于分辨染色體行為，酶解效果較好（圖4A）。酶解小于220 min時，染色體分散程度低、細(xì)胞質(zhì)濃度大，甚至細(xì)胞壁未被充分酶解，制片效果較差（圖4B）；酶解大于220 min時，出現(xiàn)了染色體變形、斷裂甚至消失的情況，難以分辨染色體形態(tài)，酶解效果差（圖4C）。

2.2.3 制片條件優(yōu)化篩選

傳統(tǒng)的火焰干燥法效果如圖5A所示，視野中的細(xì)胞存在大片未被酶液消化的細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)雜質(zhì)，表明酶解或者處理不充分；改良后的制片效果如圖5B所示，花粉母細(xì)胞細(xì)胞壁已消失，細(xì)胞質(zhì)組分少，細(xì)胞分裂時期形態(tài)清晰可辨，背景干擾較小，屬于合格制片。

綜上結(jié)果，黃花菜花粉母細(xì)胞粗線期染色體制片篩選出的最佳體系為：采集4～5 mm齡段花蕾，卡諾固定液4℃固定24 h后，混合酶液（纖維素酶∶果膠酶=2∶1）37℃酶解220 min，使用改良火焰干燥法，可得理想制片。

圖4 不同酶解時間下染色體情況Fig.4 Chromosomes at different enzymolysis time

圖5 使用不同方法獲得的染色體制片F(xiàn)ig.5 Chromosome slides obtained by different methods

2.3 FISH體系的建立及雜交結(jié)果

2.3.1 染色體固定方法篩選的結(jié)果

結(jié)果表明，經(jīng)過鉻酸溶液處理過的載玻片，在50℃下烘片2 h，或在60℃下烘片1.5 h左右均可有效避免染色體在后續(xù)步驟中的脫落。其它條件下均容易導(dǎo)致切片上染色體的不完整。

2.3.2 染色體變性條件篩選的結(jié)果

結(jié)果表明，當(dāng)切片染色體在70℃下變性3～4 min或者在80℃條件下變性2 min時，染色體均能夠解鏈與探針雜交，且在顯微鏡下觀察保持了較好的形態(tài)；在60℃條件下，探針變性不徹底，在后期雜交不上；而超過在90℃下切片上染色體形態(tài)表現(xiàn)為膨脹辨別不清。

2.3.3 雜交后洗脫強(qiáng)度的篩選結(jié)果

結(jié)果表明，以45S rDNA和5S rDNA序列做探針時，二級洗脫使用1×TNT在37℃條件下獲得的原位雜交信號比較穩(wěn)定，背景干擾很小，雜交信號清晰；洗脫溫度太高或太低，均會造成非特異信號和背景信號。

3 結(jié)論與討論

在植物FISH實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用最多的探針分子是重復(fù)DNA序列，其中最典型的是核糖體DNA（rDNA）［18］。由于其在基因組序列上的拷貝數(shù)多，在FISH中靶位點(diǎn)多，檢出率較高，重復(fù)性好，因而常在 建 立 物 種FISH體系中使用［19～21］。本試驗(yàn)首次將擬南芥45S rDNA和5S rDNA序列定位于黃花菜中期和減數(shù)分裂粗線期染色體上，但由于信號位點(diǎn)有限，尚不能實(shí)現(xiàn)同時識別全套染色體。在今后研究工作中，需要進(jìn)一步開發(fā)黃花菜全基因組范圍的串聯(lián)重復(fù)序列、單拷貝序列及oligo等多種類探針序列，充分發(fā)揮FISH技術(shù)在圖譜整合和輔助基因組組裝的優(yōu)勢，同時開展萱草屬植物的FISH研究，通過探針序列在近緣物種間的分布特征揭示其進(jìn)化關(guān)系。

為保證充足的根尖實(shí)驗(yàn)材料，本研究首次利用溫室沙培的方法成功實(shí)現(xiàn)根尖周年取材，避免了一次性大量取材長時間保存而影響制片效果。同時，由于花期較為集中，花蕾材料容易受到季節(jié)的限制，本研究通過確定粗線期花粉母細(xì)胞對應(yīng)的花蕾長度，大大提高了制片效率。這為進(jìn)一步開展后續(xù)黃花菜的FISH研究提供了重要的技術(shù)前提。

在熒光原位雜交技術(shù)中，僅獲得分散良好的中期和粗線期分裂相的染色體制片遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足實(shí)驗(yàn)要求。黃花菜的細(xì)胞質(zhì)濃厚，富含果膠、酚類等高分子次生代謝物質(zhì)，制片過程中酶解的難度較大，雜質(zhì)不易處理，將嚴(yán)重影響雜交過程中探針的滲透能力和雜交的信噪比。本研究采用改良的火焰干燥法進(jìn)行制片，通過增加乙酸處理環(huán)節(jié)，有效降低了胞質(zhì)粘度，促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)清潔，摸索出一套適用于黃花菜FISH的制片技術(shù)，該技術(shù)體系適用于黃花菜后續(xù)的FISH技術(shù)研究工作。FISH技術(shù)在黃花菜上的成功運(yùn)用，不僅彌補(bǔ)了傳統(tǒng)核型分析中單純依靠染色體形態(tài)進(jìn)行分類的局限，更為黃花菜染色體研究、物理圖譜研究及分子育種奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

圖6 黃花菜熒光原位雜交結(jié)果Fig.6 Fluorescence in situ hybridization results of H.citrina