張強(qiáng)，金恒，吳麗娟，謝喬，劉瑞平，王利華，蘇州，鐘云平，邱光忠

（1.贛州市畜牧研究所，江西贛州341401；2.贛州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局）

贛南作為全國最大的臍橙主產(chǎn)區(qū)，被譽(yù)為“世界橙鄉(xiāng)”，2019年臍橙種植面積達(dá)10.8 萬hm2，總產(chǎn)量122 萬t，產(chǎn)值129 億元。贛南臍橙深加工后副產(chǎn)物臍橙渣的營養(yǎng)較為豐富，其碳水化合物和鈣含量較高，氨基酸組分較全面，粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和磷含量偏低[1]。通過一定工藝提高臍橙渣的蛋白含量，可提升臍橙渣的營養(yǎng)價值。宋睿等[2]利用響應(yīng)面法研究冰糖橙皮固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菌體蛋白技術(shù)，冰糖橙皮真蛋白含量由19.93%提高到23.85% 。陳卓男[1]、Crosswhite[3]和Noh[4]在育肥豬日糧中分別添加贛南臍橙皮、青貯柑橘渣、發(fā)酵柑橘渣等成分，發(fā)現(xiàn)均能顯著提高肥育豬的飼料轉(zhuǎn)化率。另外，飼料微生物具有維護(hù)畜禽腸道微生態(tài)平衡、增強(qiáng)機(jī)體免疫力的功能[5～6]。因此，將臍橙渣開發(fā)成益生菌發(fā)酵飼料，即可增加植物蛋白飼料來源，又能增強(qiáng)動物免疫力，促進(jìn)畜牧行業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展。目前，關(guān)于臍橙渣制作生物發(fā)酵飼料的文獻(xiàn)報道較少。本試驗(yàn)研究了麩皮添加比例、菌種、尿素和磷酸二氫鉀對臍橙渣發(fā)酵飼料的蛋白含量的影響，旨在提高臍橙渣發(fā)酵飼料的真蛋白含量。

1 材料與方法

1.1 原料與菌種

臍橙渣：含水量約12%，購置于青島科奈爾農(nóng)產(chǎn)品有限公司；麩皮、尿素：市售；碳酸鈣：天津市北辰方正試劑廠，分析純；磷酸二氫鉀：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，分析純。

安琪高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；乳酸菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌：河南君安生物科技有限公司；產(chǎn)朊假絲酵母：無錫拜弗德生物科技有限公司；黑曲霉：濟(jì)寧玉園生物科技有限公司；纖維素酶：濟(jì)南天天香有限公司。以上菌種和酶均為細(xì)顆粒或粉末形態(tài)。

1.2 主要試劑及儀器

試劑：濃硫酸、硫酸銅、氫氧化鈉：西隴化工股份有限公司，分析純；硫酸鉀：中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司，分析純。

儀器：LAC-5080S 高壓滅菌鍋：上海博訊儀器儀表有限公司；粉碎機(jī)：河北金琦機(jī)械廠；GZX-GF101-3-BS-Ⅱ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；FA2004 電子天平：上海上平儀器有限公司；250 mL 凱氏燒瓶：蜀牛；半微量定氮蒸餾器：上海昕滬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DK-98-Ⅱ電爐：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方案

1.3.1 麩皮添加比例試驗(yàn)。本試驗(yàn)的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方包含：2%尿素，1%碳酸鈣，36.79%水，0.1%安琪酵母，0.1%乳酸菌，0.01%纖維素酶，以及麩皮和臍橙渣。各試驗(yàn)組配方中麩皮和臍橙渣的含量，見表1。

表1 麩皮添加比例試驗(yàn)配方中麩皮和臍橙渣的百分含量 %

1.3.2 不同菌種試驗(yàn)。本試驗(yàn)的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方包含：54%臍橙渣，6%麩皮，2%尿素，1%碳酸鈣，以及菌種和水。各試驗(yàn)組配方中菌種和水的含量，見表2。

表2 不同菌種試驗(yàn)配方中菌種的添加種類與百分含量 %

1.3.3 尿素濃度試驗(yàn)。本試驗(yàn)的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方包含：54%臍橙渣，6%麩皮，1%碳酸鈣，0.1%安琪酵母，0.1%乳酸菌，0.01%纖維素酶，以及尿素和水。各試驗(yàn)組配方中尿素和水的含量，見表3。

表3 尿素濃度試驗(yàn)配方中尿素的添加濃度 %

1.3.4 磷酸二氫鉀濃度試驗(yàn)。本試驗(yàn)的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方包含：54%臍橙渣，6%麩皮，2%尿素，1%碳酸鈣，0.1%安琪酵母，0.1%乳酸菌，0.01%纖維素酶，以及磷酸二氫鉀和水。各試驗(yàn)組配方中磷酸二氫鉀和水的含量，見表4。

表4 磷酸二氫鉀濃度試驗(yàn)配方中磷酸二氫鉀的添加濃度 %

1.4 操作方法

配制含菌劑的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，30±1 ℃下發(fā)酵3 d，將發(fā)酵產(chǎn)物烘干（溫度102℃），粉碎，進(jìn)行真蛋白含量測定，每個處理3 次平行試驗(yàn)。

1.5 真蛋白含量測定

將樣品加入蒸餾水中煮沸，依次加入過量的硫酸銅水溶液、氫氧化鈉溶液。在一定堿性條件下，蛋白質(zhì)被氫氧化銅沉淀，用水洗去水溶性含氮物，沉淀部分按粗蛋白的測定方法測定其含氮量[7]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，多重比較采用Duncan 新復(fù)極差法分析，P＜0.05 為有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 麩皮添加比例試驗(yàn)

本試驗(yàn)研究麩皮添加比例對發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量的影響。

圖1 麩皮添加比例對臍橙渣發(fā)酵飼料真蛋白含量的影響

結(jié)果顯示，發(fā)酵3 d 后，2 組和3 組的真蛋白含量提高較顯著（P＜0.05），相對于自身未發(fā)酵的樣品，真蛋白分別提高了7.69%、11.37%。為更好的了解臍橙渣的發(fā)酵特性，本試驗(yàn)選取輔料配比更低的組合進(jìn)行研究，故優(yōu)化后的麩皮添加比例是6%（臍橙渣添加比例是54%）。

2.2 不同菌種試驗(yàn)

本試驗(yàn)將安琪酵母與不同菌種配合來發(fā)酵臍橙渣飼料，考察不同菌種組合對發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量的影響。

圖2 不同菌種對臍橙渣發(fā)酵飼料真蛋白含量的影響

結(jié)果顯示，6 個試驗(yàn)組的真蛋白含量，與對照組相比有顯著提升（P＜0.05）。1 組、2 組、3 組、4 組之間的真蛋白含量無顯著差異（P＞0.05）；1 組、2 組、3組、4 組的真蛋白含量，比5 組、6 組的更高，且差異顯著（P＜0.05）。以上說明，1 組、2 組、3 組、4 組是較優(yōu)的菌種或菌種組合。由于乳酸菌具有較多的優(yōu)良特性，如潘小梅等[8]利用乳酸菌產(chǎn)生果膠酶等水解酶，降低柑橘皮渣中抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)含量。且乳酸菌應(yīng)用廣泛，具有保護(hù)動物（人體）腸道、提高機(jī)體免疫力等功效，所以采用安琪酵母與乳酸菌雙菌組合的方案對臍橙渣飼料進(jìn)行微生物發(fā)酵。

2.3 尿素濃度試驗(yàn)

本試驗(yàn)以尿素為無機(jī)氮源，配置成0%、1%、2%和3%等4 種尿素添加比例的臍橙渣發(fā)酵培養(yǎng)基，研究不同濃度的尿素對臍橙渣發(fā)酵飼料真蛋白含量的影響。

結(jié)果顯示，發(fā)酵3 d 后，3 個試驗(yàn)組的真蛋白含量與對照組相比，均有顯著提升（P＜0.05）。其中，2組（添加2%尿素）的真蛋白含量約為7.06%，比對照組提高了9.29%；3 組（添加3%尿素）的真蛋白含量約為6.97%，比對照組提高了7.89%。說明添加2%尿素是該固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方中尿素的較優(yōu)添加濃度。

圖3 尿素濃度對臍橙渣發(fā)酵飼料真蛋白含量的影響

2.4 磷酸二氫鉀濃度試驗(yàn)

本試驗(yàn)研究不同濃度的磷酸二氫鉀對臍橙渣發(fā)酵飼料真蛋白含量的影響。

圖4 磷酸二氫鉀濃度對臍橙渣發(fā)酵飼料真蛋白含量的影響

結(jié)果顯示，發(fā)酵3 d 后，3 個試驗(yàn)組的真蛋白含量與對照組相比，均無顯著差異（P＞0.05），可能原因是輔料麩皮中磷源含量豐富。1 組的真蛋白含量是7.21%，與對照組（7.03%）相比提高了2.56%；3組的真蛋白含量是6.91%，略低于對照組。以上試驗(yàn)結(jié)果說明，在配方中添加0.1%磷酸二氫鉀對臍橙渣發(fā)酵飼料真蛋白的合成起到一定的促進(jìn)作用。

進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)，1 組的真蛋白含量（7.21%）與其本身未發(fā)酵的樣品（6.34%）對比提高了13.72%。經(jīng)過對臍橙渣發(fā)酵飼料的固態(tài)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，臍橙渣飼料的真蛋白含量獲得較大的提升。

3 討論

3.1 麩皮添加比例試驗(yàn)

6%麩皮是臍橙渣發(fā)酵飼料較優(yōu)的輔料添加比例。如果麩皮添加比例過高，那么微生物將更多的利用有機(jī)氮源麩皮，由無機(jī)氮源尿素合成蛋白質(zhì)的量則減少，產(chǎn)物中真蛋白含量提高不顯著。曾柏全等[9]進(jìn)行了類似的研究，采用15%麩皮作為固態(tài)發(fā)酵冰糖臍橙皮渣培養(yǎng)基最優(yōu)輔料濃度。

3.2 不同菌種試驗(yàn)

確定采用安琪酵母與乳酸菌雙菌組合方案發(fā)酵臍橙渣飼料。酵母菌是高產(chǎn)蛋白菌種，本試驗(yàn)中乳酸菌與安琪酵母組合發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量較高，說明可用乳酸菌和安琪酵母組合發(fā)酵臍橙渣飼料。在柑橘皮渣文獻(xiàn)中也有菌種組合發(fā)酵的研究，如：程錦等[10]研究確定采用米曲霉/康寧木霉/熱帶假絲酵母三菌組合方案且比例為1:2:2 時，柑橘皮渣發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白最高。

3.3 尿素濃度試驗(yàn)

添加2%尿素可使臍橙渣發(fā)酵飼料的真蛋白含量獲得大幅提升。一般微生物適宜的碳氮比是25:1，本文添加2%尿素培養(yǎng)基的碳氮比接近25:1，較適合微生物生長。

3.4 磷酸二氫鉀濃度試驗(yàn)

0.1%磷酸二氫鉀是臍橙渣發(fā)酵飼料優(yōu)化的磷源添加比例。臍橙渣中磷源含量（0.22%）較低，添加適宜的磷酸二氫鉀能促進(jìn)臍橙渣飼料菌體蛋白合成。類似文獻(xiàn)[11]報道，10 g 發(fā)酵底物（不包括水含量）中添加0.04 g 磷酸二氫鉀，蛋白質(zhì)產(chǎn)量較高，且添加量在0.04～0.06 g 范圍時，蛋白質(zhì)產(chǎn)量呈負(fù)相關(guān)。

4 結(jié)論

通過研究麩皮添加比例、菌種、尿素和磷酸二氫鉀對臍橙渣發(fā)酵飼料的蛋白含量的影響，臍橙渣發(fā)酵飼料真蛋白含量達(dá)到7.21%，與發(fā)酵前樣品對比提高了13.72%。本次試驗(yàn)確定臍橙渣發(fā)酵飼料優(yōu)化后配方的主要成分為：54%臍橙渣，6%麩皮，2%尿素，1%碳酸鈣，0.1%磷酸二氫鉀，0.1%安琪酵母，0.1%乳酸菌，0.01%纖維素酶，36.69%水。