武坤毅 李勝利 姬媛媛 樊小軍 劉全征

阿司匹林(乙酰水楊酸)是重要的預(yù)防心腦血管疾病的藥物[1]，大劑量的阿司匹林可以衰減慶大霉素的耳毒性[2,3]；有研究報(bào)道阿司匹林應(yīng)用于62 261例女性未增加其聽力損失發(fā)生率[4]。在噪聲性聾研究方面，已證明阿司匹林可減少耳蝸?zhàn)杂苫漠a(chǎn)生[5]，可以抵抗噪聲導(dǎo)致的耳蝸外毛細(xì)胞(outer hair cell,OHC)損失[6]；低劑量的阿司匹林可以延緩老年性聾的發(fā)展進(jìn)程[7]。水楊酸在耳蝸的初期效應(yīng)是下調(diào)外毛細(xì)胞膜的prestin蛋白活性從而導(dǎo)致聽力損失，長期應(yīng)用則上調(diào)prestin蛋白活性，增加其表達(dá)從而導(dǎo)致耳鳴發(fā)生[8]。水楊酸具有靶向性調(diào)控耳蝸外毛細(xì)胞prestin蛋白表達(dá)的作用[9]，成為耳聾耳鳴研究的熱點(diǎn)。Chen等[10]報(bào)道老年性聾Fischer 344/NHsd小鼠耳蝸OHC prestin表達(dá)下降；本課題組前期研究證明老年性聾小鼠耳蝸OHC prestin的表達(dá)顯著下降，表明prestin可能參與老年性聾的過程，可能是老年性聾的分子機(jī)制之一，可作為老年性聾早期預(yù)防和治療的觀察指標(biāo)之一[11]。本課題組前期研究[12]證明200 mg的水楊酸長期慢性注射可以有效延緩老年性聾的發(fā)展進(jìn)程，合適劑量的水楊酸可以上調(diào)耳蝸毛細(xì)胞prestin的表達(dá)，補(bǔ)償因老年退化導(dǎo)致的prestin表達(dá)下降，使耳蝸頂部的毛細(xì)胞的損失減少，聽功能下降明顯減緩，但因?qū)Χ伒谆氐拿?xì)胞損失影響不明顯，故要進(jìn)一步阻止老年性聾的發(fā)展，尚需聯(lián)合其它方法進(jìn)行更廣泛和深入的研究。而本課題組前期應(yīng)用中藥復(fù)聰湯對耳毒性藥物中毒和噪聲性聾進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)研究已證明其可以促進(jìn)損害的毛細(xì)胞修復(fù)和再生[12，13]，并且臨床應(yīng)用此藥證明其對神經(jīng)性耳聾患者的療效顯著[14]；本課題組運(yùn)用該中藥上調(diào)因老年退行性變導(dǎo)致的耳蝸外毛細(xì)胞prestin蛋白表達(dá)下調(diào)，取得較好的預(yù)防和治療效果[15]。故本研究擬通過應(yīng)用阿司匹林聯(lián)合中藥復(fù)聰湯對年齡相關(guān)性聽力損失(age-related hearing loss, ARHL)DBA/2J小鼠進(jìn)行治療，探討中西藥聯(lián)合應(yīng)用對耳蝸外毛細(xì)胞prestin蛋白的表達(dá)及耳蝸毛細(xì)胞存活的影響，為老年性聾的預(yù)防及治療提供參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選用4周齡(W)DBA/2J近交系小鼠(南京模式動(dòng)物研究所，品系編號(hào)J000671)120只，雌雄各半。隨機(jī)分成6組，每組20只，分別為阿司匹林100 mg/kg加中藥復(fù)聰湯治療組、200 mg/kg阿司匹林加中藥復(fù)聰湯治療組、中藥復(fù)聰湯治療組、阿司匹林100 mg/kg治療組、阿司匹林200 mg/kg治療組及飲水對照組。

1.2治療方法 阿司匹林腸溶片(國藥準(zhǔn)字H20065051,沈陽奧吉娜藥業(yè)有限公司)藥品配制：DBA/2J近交系小鼠4周齡平均體重15 g，每天平均每只小鼠飲水量為5 ml，動(dòng)物按100 mg/kg的劑量每天攝入阿司匹林1.5 mg，每組20只小鼠總飲水量100 ml，總攝入阿司匹林30 mg；200 mg/kg組的劑量是前述阿斯匹林用量的一倍。100 mg/kg和200 mg/kg加中藥復(fù)聰湯組，將阿司匹林腸溶片直接融入中藥水劑中，單獨(dú)100 mg/kg和200 mg/kg阿司匹林治療組則用等量開水溶解。中藥為山東菏澤康樂醫(yī)院的復(fù)聰湯[14,15]，主要成分為桃仁、穿山甲、紅花、川芎、黃芪、萊菔子、烏藥、木香等水煎劑，藥效性能主要是活血化瘀、益氣開竅、疏通經(jīng)洛、改善耳蝸內(nèi)循環(huán)之功效[12～14]。按照《中藥藥理研究方法學(xué)》中的方法，按成人量(mg/kg)換算成動(dòng)物劑量的倍數(shù)簡表，換算出小鼠為4.5倍的劑量(這樣就平衡人與鼠之間的較大差異)，計(jì)算出小鼠的每天口服用藥量為5 ml，將中藥盛于動(dòng)物自吸喂養(yǎng)瓶內(nèi)供小鼠自動(dòng)飲用，對照組小鼠20只給予口服同劑量的飲用水。

1.3聽性腦干反應(yīng)(ABR)檢測方法 動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)前、治療30、60、90天后行ABR閾值檢測。用0.75%戊巴比妥鈉(0.1 mg/kg)麻醉后，用美國Inteligent Hearing Smart聽覺誘發(fā)電位儀檢測ABR，用針電極插入顱頂為記錄電極，兩側(cè)耳垂皮下為參考電極，鼻尖為接地電極；click聲刺激，刺激率19.1次/秒，高通濾波300 Hz，低通濾波3 000 Hz，平均疊加512次[13～15]。

1.4耳蝸鋪片方法 各組動(dòng)物檢測ABR后，在麻醉狀態(tài)下，各組取3只小鼠快速斷頭，迅速取出聽泡，分離出耳蝸，在解剖顯微鏡下(OLYMPUS,TOKYO,297261)，用纖細(xì)鋼針在耳蝸尖頂鉆一小孔，將前庭膜挑破，再挑破圓窗膜和卵圓窗膜，并在耳蝸底回骨隆起處鉆一小孔，看到外淋巴液溢出。馬上用細(xì)的滴管吸取0.5%的硝酸銀溶液，從蝸尖的小孔和兩窗反復(fù)灌入，用雙蒸餾水洗滌數(shù)次，再灌入10%的福爾馬林固定液，在日光下曝光2～4小時(shí)，解剖顯微鏡下分離鋪片。將基底膜按回放置在載玻片的甘油中，辨識(shí)正反面無誤后，加蓋蓋玻片，供光鏡觀察和進(jìn)行毛細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.5耳蝸毛細(xì)胞計(jì)數(shù) 在光鏡下(Nikon DS-fi1)，耳蝸放大40倍，從耳蝸頂回開始逐個(gè)視野連續(xù)計(jì)數(shù)內(nèi)外毛細(xì)胞存在和消失的數(shù)目，外毛細(xì)胞分排記錄。計(jì)數(shù)完后，將三排外毛細(xì)胞的存在數(shù)與消失數(shù)由蝸頂?shù)轿伒撞恐饌€(gè)視野相加，計(jì)算出毛細(xì)胞損失的百分?jǐn)?shù)；統(tǒng)計(jì)同一組的多個(gè)耳蝸相同部位的計(jì)數(shù)，制作毛細(xì)胞在耳蝸基底膜分布的存活百分率圖及耳蝸毛細(xì)胞總存活數(shù)比較圖。

1.6掃描電鏡觀察 動(dòng)物斷頭處死后,分離取出雙側(cè)聽泡,在手術(shù)顯微鏡下暴露出耳蝸,用細(xì)鋼針挑破蝸頂和耳蝸底回圓窗及卵圓窗,快速灌入2.5 mmol/L戌二醛PBS液,置4 ℃固定4 h,入1.0 mmol/L鋨酸固定2 h,PBS洗滌后在手術(shù)顯微鏡下去除耳蝸骨殼,蓋膜及部分血管紋組織,充分暴露出Corti器上的基底膜內(nèi)外毛細(xì)胞。梯度乙醇脫水,乙酸異戊酯梯度浸泡，二氧化碳臨界點(diǎn)干燥,噴金,定位后在德國FEI Verios 460 L XHR SEM超高分辨率掃描電子顯微鏡系統(tǒng)上觀察。

1.7全耳蝸鋪片prestin抗體染色 各組小鼠治療90天后取3只小鼠麻醉后，快速斷頭，分離出小鼠耳蝸，在體視顯微鏡下用纖細(xì)鋼針在耳蝸頂回鉆一小孔，沿基底膜挑破前庭膜，同時(shí)挑破圓窗膜和卵圓窗膜，將4%多聚甲醛滴注入耳蝸內(nèi)。將標(biāo)本浸入在4%多聚甲醛中4 ℃固定4 h，將耳蝸置入裝有PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中，在解剖顯微鏡下分離出耳蝸基底膜，PBS溶液中漂洗3次(5分/次)。0.5% Triton 1 h,將清洗后的基底膜標(biāo)本加入10%正常羊血清Blocker封閉30 min，再用PBS溶液漂洗3次(5分/次)。將清洗后的基底膜標(biāo)本加入配好的一抗anti-prestin(1∶500,3%羊血清溶液稀釋)放入37 ℃溫箱中過夜，次日取出標(biāo)本用PBS溶液漂洗3次(5分/次)。將清洗后的基底膜標(biāo)本加入二抗(1∶200，PBS溶液稀釋)標(biāo)記Alexa Fluor-488山羊抗兔抗體(1∶100，PBS溶液稀釋)，室溫下1 h，然后在PBS溶液漂洗3次(5分/次)。滴有DAPI核染液30 min后將標(biāo)本平鋪載玻片上，用激光共聚焦顯微鏡觀察(Leica TCS SP8)，用Image J軟件分析熒光強(qiáng)度。

1.8耳蝸基底膜全蛋白提取和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot) 各組小鼠治療90天后取3只小鼠用過量0.75%戊巴比妥鈉麻醉，迅速斷頭取出骨迷路，在干冰預(yù)冷的0.1 mol/L PBS中剝離耳蝸，取出基底膜組織，并在裂解液RIPA中粉碎，冰浴中多次劇烈振蕩使組織充分裂解，離心后收集上清液。按照BCA試劑盒說明，用酶標(biāo)儀測量蛋白溶液濃度，以每孔20 μg的上樣量行SDS-PAGE凝膠電泳，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白電轉(zhuǎn)移至規(guī)格為0.45 μm孔徑的PVDF膜。經(jīng)5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉1 h后，用適當(dāng)稀釋的抗鼠β-actin抗體、羊抗小鼠SPAG6抗體或兔抗小鼠prestin抗體在3%奶粉TBST溶液中過夜孵育(4 ℃，≥8 h)。用PBS洗滌PVDF膜3×10分/次，用相應(yīng)辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗室溫下水平緩慢搖動(dòng)孵育1～2 h，用PBS洗滌3×10分/次，加入發(fā)光底物，在暗室內(nèi)進(jìn)行醫(yī)用膠片的曝光并采集膠片圖像。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism軟件，比較組與組之間單個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差別采用t檢驗(yàn)或Mann-Whitney檢驗(yàn)，比較兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組在一個(gè)或一個(gè)以上變量不同時(shí)間點(diǎn)間的差別使用ANOVA檢驗(yàn)。各實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次或以上，非變量數(shù)據(jù)使用Mann-Whitney檢驗(yàn)分析，多變量使用方差(ANOVA)分析。

2 結(jié)果

2.1各組實(shí)驗(yàn)前后ABR閾值比較 從表1可見實(shí)驗(yàn)前6組DBA/2J小鼠ABR反應(yīng)閾為45～50 dB SPL，治療后，療效最好的是200 mg/kg阿司匹林加中藥復(fù)聰湯治療組，其次是中藥復(fù)聰湯治療組，再次是100 mg/kg阿司匹林加中藥復(fù)聰湯治療組；200 mg/kg阿司匹林治療組的ABR反應(yīng)閾隨治療時(shí)間的延長較緩慢升高，而100 mg/kg阿司匹林治療組的ABR反應(yīng)閾隨治療時(shí)間的延長快速升高，與飲水對照組基本相似，這三組治療90天后的ABR反應(yīng)閾值基本在60 dB SPL以上。從總的趨勢看，200 mg/kg阿司匹林加中藥復(fù)聰湯治療組和單獨(dú)中藥復(fù)聰湯治療組的效果相似，治療90天后的ABR反應(yīng)閾與治療前比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且200 mg/kg阿司匹林加中藥復(fù)聰湯治療組和單純中藥復(fù)聰湯治療組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而其余各組治療90天后ABR反應(yīng)閾較治療前明顯升高(P<0.05)(表1)。

表1 各組動(dòng)物治療前后ABR反應(yīng)閾值

2.2掃描電鏡觀察結(jié)果 治療90天后中藥復(fù)聰湯治療組耳蝸頂回到底回的三排外毛細(xì)胞靜纖毛束基本完整，排列整齊，纖毛束無散亂、缺失和融合現(xiàn)象(圖1a～c)，僅頂回有散在個(gè)別的外毛細(xì)胞缺失，整個(gè)耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞無消失；100 mg阿司匹林加中藥復(fù)聰湯治療組耳蝸外毛細(xì)胞頂回基本無缺失(圖1d)，中回個(gè)別消失(圖1e)，基底回有30%的OHC消失(圖1f箭頭所示)；而200 mg阿司匹林加中藥復(fù)聰湯治療組的耳蝸頂回和中回?zé)oOHC缺失(圖1g、h)，基底回有OHC1散在消失(圖1i)，基底部IHC消失(圖1)。

100 mg阿司匹林治療組頂回三排外毛細(xì)胞靜纖毛束基本完整，排列整齊，纖毛束無散亂、缺失和融合現(xiàn)象(圖2a)，中回有OHC3散在消失(圖2b)，底回的外毛細(xì)胞基本缺失(圖2c)，整個(gè)耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞無消失；200 mg阿司匹林治療組耳蝸外毛細(xì)胞頂回基本無缺失(圖2d)，中回個(gè)別消失(圖2e)，基底回有10%的OHC消失(圖2f,箭頭所示)；而飲水對照組的耳蝸頂回OHC1大量連續(xù)消失(圖2g)，中回和基底回OHC全部的消失(圖2h、2i)。

2.3各組耳蝸外毛細(xì)胞prestin表達(dá)和Western blotting蛋白定量檢測結(jié)果 各組DBA/2J小鼠治療90天后，200 mg阿司匹林加中藥復(fù)聰湯治療組的OHC prestin熒光標(biāo)記強(qiáng)度最大，其次是200 mg阿司匹林治療組，中藥復(fù)聰湯治療組的OHC中prestin熒光標(biāo)記強(qiáng)度較強(qiáng)，而100 mg阿司匹林加中藥復(fù)聰湯治療組的OHC prestin熒光標(biāo)記強(qiáng)度較弱，飲水對照組的OHC prestin熒光標(biāo)記強(qiáng)度最弱(圖3)。Western blot結(jié)果見圖4，可見1～3號(hào)的prestin蛋白密度由最大依次減弱，而4～6號(hào)prestin蛋白密度最小。

2.4各組耳蝸基底膜鋪片毛細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 治療90天后各組DBA/2J小鼠耳蝸外毛細(xì)胞存活總數(shù)最多的是中藥復(fù)聰湯治療組，與各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其次是200 mg阿司匹林加中藥復(fù)聰湯治療組，再次是200 mg阿司匹林治療組，100 mg阿司匹林治療組最少，從耳蝸頂回到底回OHC存活率見圖5。

3 討論

為了探討更有效的延緩老年性聾發(fā)展的措施，本研究在前期研究修復(fù)和再生耳蝸毛細(xì)胞的基礎(chǔ)上[12,13]，用阿司匹林腸溶片聯(lián)合中藥復(fù)聰湯對ARHL DBA/2J小鼠(老年性聾小鼠)進(jìn)行治療，觀察其對小鼠聽功能和耳蝸毛細(xì)胞的保護(hù)效果，結(jié)果表明，無論是對耳蝸OHC的存活還是OHC prestin的表達(dá)，單獨(dú)中藥治療組的效果均為最好；而治療前后ABR反應(yīng)閾值的比較顯示200 mg阿司匹林加中藥治療組效果更好，其次是單獨(dú)中藥治療組，說明阿司匹林雖然沒有促進(jìn)OHC的存活，但可促進(jìn)OHC prestin的表達(dá)，亦對聽功能的改善有一定作用。有研究報(bào)告，耳蝸底回的毛細(xì)胞較頂回更易受到自由基的損害，水楊酸能顯著改善底回毛細(xì)胞的存活[16]，但本研究并沒有觀察到該結(jié)果，這可能與本研究采用的動(dòng)物種系有關(guān)，因?yàn)橐延醒芯勘砻鞑煌N系的動(dòng)物對卡路里限制(caloric restriction，CR)的抗氧化預(yù)防治療年齡相關(guān)性聽力損失效果不同，其中DBA/2J小鼠效果較差[17,18]。根據(jù)既往研究結(jié)果，結(jié)合本研究結(jié)果，老年性聾小鼠耳蝸毛細(xì)胞損失始于基底部，要有效地預(yù)防和治療老年性聾，關(guān)鍵是要采取切實(shí)可行措施以促進(jìn)耳蝸基底部的毛細(xì)胞存活和延緩或阻止毛細(xì)胞死亡。在研究治療措施時(shí)，要考慮到耳蝸頂部與基底部毛細(xì)胞的遺傳及分子機(jī)制的差異問題，以及藥物分子作用的靶點(diǎn)和途徑不同，還要考慮到耳蝸結(jié)構(gòu)與病理改變的時(shí)空序列，以及預(yù)防治療策略之間多方面的科學(xué)契合問題。

文中結(jié)果顯示，單獨(dú)中藥復(fù)聰湯治療組對延緩老年性聾的效果更好，其次是200 mg阿司匹林加中藥復(fù)聰湯治療組，說明中藥的治療作用是正向促進(jìn)毛細(xì)胞存活，而200 mg阿司匹林+中藥治療組的中西藥聯(lián)合或許有一定的毒副作用，阿司匹林僅對耳蝸OHC prestin表達(dá)有特異的促進(jìn)作用。既往研究表明，毛細(xì)胞的存活與螺旋神經(jīng)元(SGNs)的狀態(tài)有密切關(guān)系，毛細(xì)胞對于螺旋神經(jīng)元的存活是必需的，毛細(xì)胞消失或毛細(xì)胞功能消失后，SGNs不能激活或最大程度減低電激活水平；毛細(xì)胞死亡后SGNs也很快消失，連接到Corti器的外周軸突甚至死亡[17～20]；這些研究從另一方面提示了耳蝸組織退變的系列連貫性病理改變以及病變的時(shí)空分類或程度。所以，在治療年齡相關(guān)性聽力損失時(shí)，除了促進(jìn)毛細(xì)胞恢復(fù)，同時(shí)還要充分考慮對螺旋神經(jīng)元等組織的修復(fù)作用；而本課題組的前期實(shí)驗(yàn)亦證明中藥復(fù)聰湯對老年性聾小鼠的耳蝸OHC prestin表達(dá)有促進(jìn)作用[15]。在臨床治療方面，雷劍波等[14]應(yīng)用復(fù)聰湯治療45例神經(jīng)性聾患者，結(jié)果證明復(fù)聰湯能降低患者血清NO、Connexin26、Connexin30的表達(dá)水平，臨床療效顯著。因此，阿斯匹林聯(lián)合復(fù)聰湯治療老年性聾并不具備明顯的優(yōu)勢，而復(fù)聰湯的組方似乎更為合理，其組方中含有多種化學(xué)成分，可能具有多靶點(diǎn)的治療作用，這也是該中藥治療的優(yōu)勢所在；但更有效的組方或更有效的治療藥物組合尚需進(jìn)一步探討。除了繼續(xù)探索合理的治療方法及途徑之外，可能關(guān)鍵的問題尚未探明，即老年性聾耳蝸毛細(xì)胞的死亡方式可能并不是只有凋亡一種機(jī)制，可能還存在尚未探明的死亡方式和時(shí)空序列，如何阻止和逆轉(zhuǎn)這種進(jìn)程，是今后尚待繼續(xù)深入探索和研究的課題。