嚴(yán)大為，高嶧涵，盛云華，梁德民，胡玥， 鄭賽晶

1 上海新型煙草制品研究院，基礎(chǔ)研究室，上海浦東新區(qū)秀浦路3733號(hào) 201315；

2 上海市食品藥品檢驗(yàn)所，藥理毒理室，上海浦東新區(qū)張衡路1500號(hào) 201203；

3 上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司，技術(shù)中心，上海浦東新區(qū)秀浦路3733號(hào) 201315

丙三醇（Glycerol，俗稱甘油，CAS 號(hào)：56-81-5）是一種無(wú)色、透明、無(wú)臭、味甜的粘稠液體，由于其具有保濕、塑化、調(diào)味、增稠、防腐等功效，在煙草、化妝品、涂料、紡織、食品和醫(yī)藥等行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用[1]。在傳統(tǒng)卷煙制品中通常使用1%～5%的丙三醇作為保濕劑和煙用香精香料的表面活性劑[2]。

近年來(lái)，隨著新型煙草制品的興起，丙三醇已經(jīng)成為煙用原料中重要組成部分，尤其在電子煙中，丙三醇常作為電子煙煙液的霧化劑，含量可高達(dá)90%以上[3]。因此，關(guān)于丙三醇毒性的研究也變得尤其重要。丙三醇作為食品添加劑，它的經(jīng)口毒性已經(jīng)有相關(guān)報(bào)道。例如，文獻(xiàn)報(bào)道丙三醇大鼠經(jīng)口途徑的LD50值為25 g/kg，經(jīng)口毒性相對(duì)較低[4]；除此之外，在重復(fù)劑量試驗(yàn)中，按照10 g/kg 劑量對(duì)小鼠進(jìn)行持續(xù)經(jīng)口染毒25周，也未發(fā)現(xiàn)明顯的毒性效應(yīng)[5-6]。然而，關(guān)于丙三醇霧化吸入毒性的研究還比較少，迄今為止，只有Greenspan 和Renne 課題組對(duì)丙三醇的霧化吸入毒性進(jìn)行了相關(guān)的報(bào)道[7-8]。Greenspan 等人將大鼠分別暴露在1 mg/L、2 mg/L 和4 mg/L 的丙三醇?xì)馊苣z中2 周，未發(fā)現(xiàn)攝食量、血液學(xué)和主要器官受到丙三醇的毒性作用[7]。Renne 等人將SD 大鼠口鼻分別暴露在0 mg/L、0.033 mg/L、0.167 mg/L、和0.662 mg/L 的丙三醇?xì)馊苣z中，每天6 小時(shí)，每周5 天，持續(xù)13 周，試驗(yàn)結(jié)果表明丙三醇對(duì)上支氣管的上皮細(xì)胞造成輕度的刺激[8]。盡管Greenspan 和Renne 等人研究了丙三醇的霧化吸入毒性，但是丙三醇的濃度相對(duì)較低（≤4 mg/L），與市面銷售電子煙氣溶膠中的丙三醇最低濃度4.45 mg/L 仍有差距，然而關(guān)于高濃度、高劑量的丙三醇吸入毒性的研究還相對(duì)較少。由于電子煙煙液中霧化劑丙二醇和丙三醇的濃度和比例較高，且丙二醇前期已經(jīng)做過(guò)相關(guān)研究[9]。因此進(jìn)一步研究高濃度、高劑量丙三醇的吸入毒性十分必要，這也與消費(fèi)者使用電子煙過(guò)程中大量吸入丙三醇?xì)馊苣z的安全性密切相關(guān)。因此，本文擬通過(guò)90天的口鼻暴露高濃度、高劑量的丙三醇霧化劑，研究其對(duì)Wistar 大鼠的吸入毒性作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與主要儀器

丙三醇（華寶食用香精香料（上海）有限公司）；Bayer ADVIA120 血球分析儀；Hitachi 7020 全自動(dòng)生化分析儀；Easy Lyte Plus 鈉鉀氯分析儀；Sysmex CA1500 全自動(dòng)血凝儀；Clinitek Status 尿液分析儀；MICROM STP 120 旋轉(zhuǎn)式組織處理機(jī)；MICROM EC 350 組織包埋處理中心；MICROM HM 315 旋轉(zhuǎn)切片機(jī)；MICROM HMS 740 自動(dòng)組織切片染色機(jī)；IES-N 口鼻式吸入暴露系統(tǒng)；INTOX 粒徑譜儀；高效毛細(xì)管氣溶膠發(fā)生器（專利號(hào)：7114190，自制）； 玻璃纖維濾片（Borgwaldt KC Gmbh Schnackenburgallee）；37 mm 濾膜盒；Rnnova43 恒溫?fù)u床；CP224S 型分析天平；CASELLA 個(gè)體采樣泵；TSE 流量計(jì)；Copley 真空抽氣泵；Agilent1890 氣相色譜儀。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與劑量設(shè)置

SPF 級(jí)Wistar 大 鼠120 只（ 北 京 維 通 利華試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：11400700258487），雌雄各半，4～6 周齡，購(gòu)入后在上海市食品藥品檢驗(yàn)所藥理毒理室實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（滬）2018-0016。試驗(yàn)期間飼養(yǎng)在溫度（20～25）℃，相對(duì)濕度為40%～70%，12 小時(shí)光照/黑暗循環(huán)的條件下，提供充足的食物和水。本研究符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理原則，已通過(guò)上海市食品藥品檢驗(yàn)所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)的審查，編號(hào)為IACUCSIFDC17102。

本試驗(yàn)采用大鼠鼻吸入染毒來(lái)考察丙三醇?xì)馊苣z的毒性，設(shè)置陰性對(duì)照組和高、中、低劑量組，每組30 只動(dòng)物，雌雄各半。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，設(shè)置受試物高、中、低劑量組劑量分別為750 mg/kg、100 mg/kg、10 mg/kg，預(yù)設(shè)高、中、低氣溶膠濃度分別為15 mg/L、2 mg/L、0.2 mg/L。丙三醇?xì)馊苣z濃度每日測(cè)定1 次，按照設(shè)定染毒劑量，并根據(jù)試驗(yàn)動(dòng)物體重和測(cè)定的氣溶膠濃度調(diào)整吸入染毒時(shí)間。陰性對(duì)照組吸入空氣，吸入時(shí)間與受試物組中吸入時(shí)間最長(zhǎng)的一組一致。每日將試驗(yàn)動(dòng)物放入暴露塔中，進(jìn)行分批暴露1 次，連續(xù)給予90 天，每周5 次，恢復(fù)期為28 天。吸入暴露時(shí)間可根據(jù)吸入劑量和氣溶膠濃度計(jì)算得出，計(jì)算公式如下：

公式1：吸入劑量（mg/kg）=氣溶膠濃度（mg/L air）×每分呼吸量（L/min）×暴露時(shí)間（min）/ 體重（kg），

每分鐘呼吸量和體重的關(guān)系如下公式：

公式2： Vm= 0.499 BW0.809（R2= 0.975，BW：動(dòng)物體重，Vm：每分鐘呼吸量）[9]

在試驗(yàn)過(guò)程中，在動(dòng)物鼻暴露的每個(gè)暴露口采樣一次，計(jì)算丙三醇?xì)馊苣z的濃度（mg/L），每日氣溶膠濃度監(jiān)測(cè)值異常偏高或偏低則提示氣溶膠暴露發(fā)生控制系統(tǒng)存在異常，則進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整，保證整個(gè)染毒周期氣溶膠濃度的穩(wěn)定性和均一性。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

在90 天鼻吸入暴露期和28 天恢復(fù)期內(nèi)，每天密切觀察試驗(yàn)動(dòng)物臨床癥狀，包括一般狀況觀察、中毒情況與死亡情況，定期測(cè)量動(dòng)物體重和耗食量，并進(jìn)行眼科檢查。

在第90 天暴露期和28 天恢復(fù)期結(jié)束后，采用代謝籠收集尿液進(jìn)行分析，并進(jìn)行大體解剖。解剖大鼠時(shí)，采用烏來(lái)糖按照1 g/kg 腹腔注射麻醉動(dòng)物，麻醉后腹主動(dòng)脈取血，分別取3 mL、2 mL 和3 mL 血液進(jìn)行血常規(guī)、血凝和血生化的檢測(cè)。解剖取材后，對(duì)取材組織或臟器進(jìn)行大體觀察和稱重，然后固定于10%福爾馬林固定液（眼球和睪丸固定于Bouin's 液）中，固定好后進(jìn)行常規(guī)包埋、切片及染色進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。肺部?jī)H左肺放入固定液，右肺進(jìn)行灌洗，收集肺泡灌洗液，測(cè)定灌洗液中總蛋白（TP）、堿性磷酸酶（ALP）、乳酸脫氫酶（LDH）的含量，并對(duì)細(xì)胞分類和計(jì)數(shù)。

在進(jìn)行組織病理學(xué)檢查時(shí)，先對(duì)陰性對(duì)照組、高劑量組和尸檢異常動(dòng)物進(jìn)行詳細(xì)檢查，如高劑量組動(dòng)物某一組織發(fā)生病理改變時(shí)，再對(duì)其他劑量組動(dòng)物的相同組織進(jìn)行檢查[10]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)方法

體重、耗食量、臟器重量及臟器系數(shù)及臨檢的各項(xiàng)數(shù)據(jù)均屬于定量數(shù)據(jù)，用±s 表示，并注明單位，對(duì)日常大體觀察結(jié)果與組織病理學(xué)檢查的結(jié)果，采用半定量的方式或文字表述。

統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS 19.0，按照以下程序統(tǒng)計(jì)：①首先進(jìn)行Levene’s 檢驗(yàn)，當(dāng)P ＞0.05，則進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）；當(dāng)P ≤0.05，則進(jìn)行Kruskalwallis 檢驗(yàn)。②當(dāng)ANOVA 結(jié)果顯著（P ≤0.05），則進(jìn)一步用Dunnett 檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)；當(dāng)ANOVA 結(jié)果無(wú)顯著性差異（P ＞0.05），則統(tǒng)計(jì)結(jié)束。③當(dāng)Kruskal-wallis 檢驗(yàn)結(jié)果顯著（P ≤0.05），則進(jìn)一步用Kruskal-wallis 的單因素ANOVA 多重比較檢驗(yàn)；當(dāng)Kruskal-wallis 檢驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有顯著性顯著（P ＞0.05），則統(tǒng)計(jì)結(jié)束。

2 結(jié)果

2.1 氣溶膠濃度與粒徑分析

試驗(yàn)期間通過(guò)氣相色譜檢測(cè)分析氣溶膠樣品， 試驗(yàn)大鼠吸入丙三醇?xì)馊苣z的濃度與設(shè)計(jì)值一致。丙三醇?xì)馊苣z質(zhì)量中位數(shù)空氣動(dòng)力學(xué)直徑（MMAD）均值分別為（0.76±0.17）μm、（2.02±0.37）μm、（2.65±0.50）μm；幾何標(biāo)準(zhǔn)差（GSD）均值分別為5.38±1.10、3.18±0.63、2.68±0.30（詳 見(jiàn) 表1），受試物高、中、低組平均吸入時(shí)間分別為83 min、93 min、71 min，丙三醇?xì)馊苣z顆?？梢员辉囼?yàn)大鼠順利吸入。陰性對(duì)照組吸入空氣，吸入時(shí)間與受試物組中吸入時(shí)間最長(zhǎng)的一組一致。

表1 試驗(yàn)期間丙三醇?xì)馊苣z濃度和粒徑結(jié)果Tab. 1 Glycerol aerosol concentration and particle size during test

2.2 一般癥狀觀察與眼檢

試驗(yàn)期間大鼠染毒后均有不同數(shù)量動(dòng)物出現(xiàn)眼周及鼻部出血，次日染毒前觀察均恢復(fù)正常。試驗(yàn)期間，各組動(dòng)物均精神狀態(tài)良好，動(dòng)物的毛色、行為活動(dòng)、采食、飲水、二便、呼吸均未見(jiàn)明顯異常。于試驗(yàn)開(kāi)始前、試驗(yàn)染毒第8 周、第13 周和恢復(fù)期第4 周對(duì)大鼠進(jìn)行眼科檢查，試驗(yàn)大鼠眼球血管分布均勻、清晰可見(jiàn)、未見(jiàn)充血等明顯異常（見(jiàn)圖1）。

圖1 雄性試驗(yàn)大鼠眼檢圖（A 陰性對(duì)照組；B 高劑量組）Fig . 1 Eye examination in male rats ( A: Control group; B: High dose group )

2.3 體重與耗食量

試驗(yàn)期間，與陰性對(duì)照組相比，恢復(fù)期第2 周和3 周，中劑量組雄性大鼠體重有所降低，但未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其余各劑量組雌雄動(dòng)物體重均未見(jiàn)明顯升高或降低（見(jiàn)圖2）。

圖2 試驗(yàn)期間雄性和雌性大鼠體重和耗食量情況，a) 雄性大鼠體重情況, b) 雌性大鼠體重情況, c) 雄性大鼠耗食量情況和d) 雌性大鼠耗食量情況Fig. 2 Change of body weight and food consumption of male and female rats in each group, a) body weight of male rats, b) body weight of female rats, c) food consumption of male rats and d) food consumption of female rats

染毒期間，與陰性對(duì)照組相比，雄性大鼠中劑量組攝食量略低于陰性對(duì)照組，其中第3 周耗食量明顯低于陰性對(duì)照組（P＜0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；雌性大鼠中、高劑量組攝食量略低于陰性對(duì)照組，其中高劑量組第6 和11 周耗食量明顯低于陰性對(duì)照組（P ＜0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)圖2）。

2.4 血液學(xué)指標(biāo)

試驗(yàn)期間，僅恢復(fù)期雄性動(dòng)物中劑量組，與陰性對(duì)照組相比，MCH（平均紅細(xì)胞血紅蛋白）水平上升（P＜0.05）；PLT（血小板數(shù)）水平下降（P ＜0.05）。剩余各組試驗(yàn)動(dòng)物血液學(xué)各項(xiàng)檢查指標(biāo)均未見(jiàn)明顯差異（P＞0.05），結(jié)果見(jiàn)表2 和表3。

2.5 血液生化學(xué)指標(biāo)

與陰性對(duì)照組相比，染毒期和恢復(fù)期結(jié)束后，丙三醇暴露組中雌雄大鼠的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶（ALT）、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、總膽紅素（TB）、血糖（GLU)、尿素氮（BUN）、肌酐（CRE）、總膽固醇（CHO）、甘油三酯（TG）、肌酸磷酸激酶（CK）、鈉離子濃度（Na+）、鉀離子濃度（K+）和氯離子濃度（Cl-）等血生化指標(biāo)，均未見(jiàn)明顯差異（P＞0.05）。

檢測(cè)數(shù)據(jù)見(jiàn)電子稿附表1，附表2。

2.6 尿液

染毒期與恢復(fù)期結(jié)束后，對(duì)試驗(yàn)大鼠的尿液中的尿糖、尿蛋白、尿膽紅素、尿膽原、潛血、酮體、白細(xì)胞、尿亞硝酸鹽、尿比重和pH 值等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，與陰性對(duì)照組相比，恢復(fù)期低劑量組雄性動(dòng)物尿比重高于陰性對(duì)照組（P ＜0.05），其他組未見(jiàn)明顯差異；剩余指標(biāo)為描述性指標(biāo)，結(jié)果均為正?；蜿幮裕斍橐?jiàn)表4 和表5。

表2 對(duì)雄性大鼠血液學(xué)檢查結(jié)果的影響（±s）Tab. 2 Effect of inhaled glycerol on hematology results in male rats (±s)

表2 對(duì)雄性大鼠血液學(xué)檢查結(jié)果的影響（±s）Tab. 2 Effect of inhaled glycerol on hematology results in male rats (±s)

注：染毒期數(shù)據(jù)n=10，恢復(fù)期數(shù)據(jù)n=5，*與陰性對(duì)照組相比P＜0.05。

指 標(biāo) 陰性對(duì)照組 受試物組高中低染毒期WBC /（×109/L） 4.35±0.81 3.96±1.38 4.00±1.01 3.86±0.80 RBC /（×1012/L） 8.49±0.20 8.54±0.72 8.56±0.55 8.29±0.25 HGB /（g/dL） 15.22±0.29 15.56±0.85 15.38±1.10 15.04±0.62 HCT /（%） 46.57±0.93 47.31±3.84 47.53±3.77 45.36±1.89 MCV /（fL） 54.87±1.29 55.42±1.81 55.52±2.11 54.73±1.26 MCH /（pg） 17.95±0.43 18.28±1.24 17.98±0.55 18.17±0.90 MCHC /（g/dL） 32.68±0.36 32.98±1.80 32.38±0.60 33.19±1.72 PLT /（×109/L） 1048±95 1003±86 973±112 935±100 Neut /（×109/L） 1.05±0.17 1.07±0.40 1.10±0.48 1.02±0.45 Lymph /（×109/L） 2.90±0.65 2.52±0.86 2.52±0.49 2.49±0.52 Mono /（×109/L） 0.19±0.05 0.17±0.08 0.19±0.09 0.20±0.08 Eos（×109/L） 0.06±0.02 0.06±0.02 0.07±0.03 0.06±0.01 Baso /（×109/L） 0.05±0.01 0.05±0.04 0.04±0.03 0.04±0.02 Retic /（×109/L） 191.5±32.7 218.1±38.8 227.9±38.8 189.4±19.1 APTT /（s） 12.8± 1.1 12.6± 0.8 13.2±0.8 13.0±1.5 Fbg /（g/L） 2.2± 0.2 2.2± 0.1 2.1±0.1 2.2±0.1 PT /（s） 10.0± 0.7 9.8± 0.4 9.9±0.7 9.6±0.2 TT /（s） 54.2±5.3 51.3± 3.8 53.1±5.3 51.6±3.3恢復(fù)期WBC（×109/L） 4.35±0.91 4.65±1.23 4.25±1.12 6.19±2.36 RBC（×1012/L） 8.65±0.30 8.50±0.45 8.39±0.38 8.73±1.09 HGB（g/dL） 15.24±0.62 15.50±0.48 15.64±0.62 15.56±0.84 HCT /（%） 45.76±1.93 46.40±1.30 46.52±2.00 45.86±4.94 MCV /（fL） 52.90±1.48 54.64±1.59 55.48±0.79 52.60±2.96 MCH /（pg） 17.62±0.43 18.22±0.63 18.68±0.26* 17.92±1.29 MCHC /（g/dL） 33.34±0.40 33.36±0.58 33.60±0.19 34.12±2.19 PLT /（×109/L） 1101±79 1102±92 922±40* 1164±152 Neut /（×109/L）） 1.27±0.13 1.39±0.73 1.07±0.38 2.29±2.20 Lymph /（×109/L） 2.69±0.75 2.80±0.50 2.86±0.75 3.36±0.72 Mono /（×109/L） 0.23±0.08 0.26±0.14 0.18±0.11 0.33±0.23 Eos /（×109/L） 0.08±0.03 0.09±0.04 0.07±0.03 0.08±0.01 Baso /（×109/L） 0.04±0.02 0.04±0.02 0.04±0.02 0.05±0.03 Retic /（×109/L） 239.0±30.5 262.6±13.0 239.9±36.7 260.0±45.1 APTT /（s） 18.0± 1.1 17.4± 1.4 17.9±2.0 17.3±1.7 Fbg /（g/L） 2.0± 0.1 2.0± 0.1 1.9±0.1 2.6±1.2 PT /（s） 9.2± 0.1 9.2± 0.2 8.9±0.2 9.1±0.1 TT /（s） 54.3±8.0 50.4± 3.6 53.0±8.5 58.5±8.2

表3 對(duì)雌性大鼠血液學(xué)檢查結(jié)果的影響（±s）Tab. 3 Effect of inhaled glycerol on hematology results in female rats (±s)

表3 對(duì)雌性大鼠血液學(xué)檢查結(jié)果的影響（±s）Tab. 3 Effect of inhaled glycerol on hematology results in female rats (±s)

注：染毒期數(shù)據(jù)n=10，恢復(fù)期數(shù)據(jù)n=5，*與陰性對(duì)照組相比P＜0.05。

指 標(biāo) 陰性對(duì)照組 受試物組高中低染毒期WBC /（×109/L） 3.75±1.11 3.49±0.85 4.09±2.60 3.00±0.97 RBC /（×1012/L） 7.72±0.25 7.54±0.42 7.73±0.27 7.72±0.31 HGB /（g/dL） 14.55±0.54 14.64±0.36 14.73±0.51 14.48±0.64 HCT /（%） 43.70±1.12 43.27±1.40 44.10±1.33 43.74±1.77 MCV /（fL） 56.63±1.10 57.45±1.89 57.09±0.60 56.69±1.66 MCH /（pg） 18.87±0.58 19.46±1.32 19.08±0.32 18.78±0.62 MCHC /（g/dL） 33.31±0.57 33.84±1.41 33.46±0.39 33.11±0.37 PLT /（×109/L） 1103±208 992±154 1004±96 999±137 Neut /（×109/L） 0.99±0.37 0.73±0.29 0.80±0.28 0.64±0.26 Lymph /（×109/L） 2.48±0.79 2.47±0.64 3.03±2.37 2.14±0.77 Mono /（×109/L） 0.14±0.06 0.14±0.05 0.13±0.06 0.11±0.04 Eos /（×109/L） 0.06±0.02 0.08±0.03 0.06±0.01 0.05±0.01 Baso /（×109/L） 0.03±0.01 0.03±0.01 0.03±0.03 0.02±0.01 Retic /（×109/L） 241.7±23.8 227.0±37.7 253.6±70.1 228.5±47.5 APTT /（s） 14.9± 2.0 14.5± 1.0 16.8±4.2 14.7±1.0 Fbg /（g/L） 1.6± 0.1 1.5± 0.1 1.4±0.2 1.5±0.1 PT /（s） 8.9± 0.3 9.2± 0.4 9.2±0.4 9.0±0.4 TT /（s） 50.4±4.9 46.9± 3.9 47.5±6.5 51.0±2.6恢復(fù)期WBC /（×109/L） 2.84±1.01 3.38±1.12 2.67±0.61 2.70±1.49 RBC /（×1012/L） 8.20±0.42 7.98±0.56 8.10±0.50 7.95±0.34 HGB /（g/dL） 15.82±0.85 15.52±0.53 15.38±1.10 15.10±0.57 HCT /（%） 46.88±2.39 46.02±2.58 45.38±3.12 45.14±1.98 MCV /（fL） 57.26±1.21 57.74±1.09 56.06±0.63 56.80±1.20 MCH /（pg） 19.32±0.22 19.46±0.86 19.00±0.29 18.98±0.63 MCHC /（g/dL） 33.74±0.44 33.72±0.91 33.88±0.43 33.46±0.54 PLT /（×109/L） 892±81 925±139 928±146 1056±245 Neut /（×109/L） 0.75±0.31 0.72±0.11 0.57±0.10 0.65±0.54 Lymph /（×109/L） 1.83±0.73 2.34±0.99 1.87±0.52 1.81±0.84 Mono /（×109/L） 0.14±0.04 0.17±0.05 0.11±0.04 0.12±0.08 Eos /（×109/L） 0.05±0.02 0.05±0.02 0.06±0.01 0.05±0.02 Baso /（×109/L） 0.03±0.01 0.04±0.01 0.02±0.01 0.02±0.01 Retic /（×109/L） 261.5±23.4 271.2±38.4 234.2±32.0 250.4±30.8 APTT /（s） 17.3± 1.3 17.8± 0.8 17.6±0.6 18.8±4.0 Fbg /（g/L） 1.5± 0.2 1.3± 0.1 1.3±0.2 1.4±0.2 PT /（s） 8.4± 0.2 8.5± 0.1 8.4±0.1 8.3±0.2 TT /（s） 45.6±2.4 46.1± 3.6 46.7±3.6 46.9±7.0

表4 對(duì)雄性大鼠尿液的影響（±s）Tab. 4 Effect of inhaled glycerol on urine of male rats (±s)

表4 對(duì)雄性大鼠尿液的影響（±s）Tab. 4 Effect of inhaled glycerol on urine of male rats (±s)

注：染毒期數(shù)據(jù)n=10，恢復(fù)期數(shù)據(jù)n=5，**與陰性對(duì)照組相比P＜0.01。

指 標(biāo) 陰性對(duì)照組 受試物高劑量組 受試物中劑量組 受試物低劑量組染毒期尿比重 1.012±0.003 1.013±0.002 1.015±0.006 1.013±0.006 pH 6.7±0.4 6.7±0.4 6.5±0.4 6.6±0.5恢復(fù)期尿比重 1.011±0.002 1.011±0.002 1.013±0.003 1.020±0.004**pH 6.8±0.3 7.0±0.0 6.9±0.2 6.6±0.4

表5 對(duì)雌性大鼠尿液的影響（±s）Tab. 5 Effect of inhaled glycerol on urine of female rats (±s)

表5 對(duì)雌性大鼠尿液的影響（±s）Tab. 5 Effect of inhaled glycerol on urine of female rats (±s)

注：染毒期數(shù)據(jù)中低劑量組n=9（由于意外串籠致懷孕后處死），其余n=10，恢復(fù)期數(shù)據(jù)n=5。

指 標(biāo) 陰性對(duì)照組 受試物高劑量組 受試物中劑量組 受試物低劑量組染毒期尿比重 1.013±0.005 1.013±0.003 1.011±0.002 1.016±0.006 pH 6.2±0.4 6.3±0.3 6.4±0.4 6.4±0.6恢復(fù)期尿比重 1.014±0.004 1.020±0.006 1.014±0.004 1.016±0.008 pH 6.3±0.4 6.1±0.4 6.5±0.4 6.1±0.5

2.7 臟器重量

試驗(yàn)期間，染毒期中受試物高劑量組雌性動(dòng)物肝臟重量、腎臟重量均低于陰性對(duì)照組（P＜0.01）；恢復(fù)期中受試物中劑量組雄性動(dòng)物肺臟重量低于陰性對(duì)照組（P＜0.01），但雌雄試驗(yàn)大鼠的臟器系數(shù)（與體重的比值）均未發(fā)生顯著性差異，結(jié)果見(jiàn)表6 和表7，以及電子稿附表3，附表4。

2.8 肺部支氣管灌洗液

試驗(yàn)期間對(duì)雌雄試驗(yàn)動(dòng)物各劑量組支氣管肺泡灌洗液中TP（總蛋白）、ALP（堿性磷酸酶）、LDH（乳酸脫氫酶）、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，與陰性對(duì)照組相比，染毒期各劑量組雄性大鼠的LDH、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞比例均值略低，但在恢復(fù)期低劑量組雄性大鼠的LDH 和淋巴細(xì)胞比例均值略高，中性粒細(xì)胞比例均值略低，但未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其余指標(biāo)均未見(jiàn)明顯差異。檢測(cè)數(shù)據(jù)見(jiàn)電子稿附表5，附表6。

2.9 組織病理學(xué)檢查

試驗(yàn)結(jié)束后，將染毒期、恢復(fù)期的試驗(yàn)動(dòng)物組織進(jìn)行制片，對(duì)陰性對(duì)照組和受試物高劑量組大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)：大腦、小腦、腦干、腦垂體、脊髓、坐骨神經(jīng)；循環(huán)系統(tǒng)：心臟、主動(dòng)脈；呼吸系統(tǒng)：肺臟；消化系統(tǒng)：食管、小腸、大腸、肝臟、胰腺等消化腺；泌尿生殖系統(tǒng)：腎臟、睪丸、附睪、卵巢、子宮、乳腺；淋巴造血系統(tǒng)：脾臟、胸腺、淋巴結(jié)組織；內(nèi)分泌及其他組織：甲狀腺、甲狀旁腺、腎上腺；眼球及哈氏腺優(yōu)先進(jìn)行病理檢查，僅陰性對(duì)照組發(fā)現(xiàn)1 例心內(nèi)膜下心肌細(xì)胞壞死，炎細(xì)胞浸潤(rùn)（++，中度）的病變，其余陰性對(duì)照組和受試物高劑量組動(dòng)物組織均未見(jiàn)明顯病理性改變（見(jiàn)圖3）。

表6 對(duì)雄性大鼠臟器重量的影響（±s，g）Tab. 6 Effect of inhaled glycerol on the organ weight of male animals（±s，g）

表6 對(duì)雄性大鼠臟器重量的影響（±s，g）Tab. 6 Effect of inhaled glycerol on the organ weight of male animals（±s，g）

注：染毒期數(shù)據(jù)n=10，恢復(fù)期數(shù)據(jù)n=5，**與陰性對(duì)照組相比P＜0.01。

指 標(biāo) 陰性對(duì)照組 受試物高劑量組 受試物中劑量組 受試物低劑量組染毒期腦2.0349±0.0758 2.0716±0.0768 2.0148±0.0570 2.0626±0.1163心臟 1.2606±0.1149 1.3289±0.0945 1.2746±0.0675 1.2540±0.0898肝臟 11.2431±0.9363 11.9248±1.2979 10.0655±3.3125 11.9106±0.9991腎臟 2.8848±0.2913 2.8879±0.2880 2.8055±0.2149 2.9052±0.3197腎上腺 0.0655±0.0121 0.0693±0.0152 0.0711±0.0114 0.0708±0.0065胸腺 0.3091±0.0658 0.2710±0.0478 0.2832±0.0917 0.3234±0.0693脾臟 0.8786±0.1163 0.8276±0.1268 0.8169±0.1232 0.8735±0.1442睪丸 3.6834±0.1637 3.7672±0.2496 3.6670±0.3084 3.6086±0.3640附睪 1.3665±0.1935 1.3990±0.1676 1.3558±0.1552 1.3527±0.1130肺臟 1.4945±0.0678 1.6844±0.2773 1.5508±0.1223 1.5231±0.1103恢復(fù)期腦2.0561±0.1311 2.0814±0.0620 2.0203±0.0745 2.1155±0.1116心臟 1.4187±0.2140 1.3748±0.1664 1.2244±0.1167 1.3669±0.1233肝臟 12.9954±1.2937 14.6627±4.4130 12.2081±2.0180 14.2923±1.3596腎臟 3.0250±0.3330 2.9062±0.4130 2.7076±0.2618 3.0503±0.1434腎上腺 0.0641±0.0080 0.0586±0.0042 0.0549±0.0114 0.0660±0.0109胸腺 0.3095±0.0456 0.3895±0.1154 0.3109±0.0980 0.3029±0.0500脾臟 0.9293±0.1203 0.9957±0.1005 0.8268±0.1659 0.9155±0.1017睪丸 3.7253±0.3243 3.3898±0.5278 3.4235±0.2400 3.7076±0.4177附睪 1.4855±0.0914 1.3254±0.1735 1.2622±0.1470 1.3673±0.1155肺臟 1.7475±0.1190 1.6808±0.1500 1.4641±0.1139** 1.6253±0.0630

表7 對(duì)雌性大鼠臟器重量的影響（±s，g）Tab. 7 Effect of inhaled glycerol on the organ weight of female animals（±s，g）

表7 對(duì)雌性大鼠臟器重量的影響（±s，g）Tab. 7 Effect of inhaled glycerol on the organ weight of female animals（±s，g）

注：染毒期數(shù)據(jù)中低劑量組n=9（由于意外串籠致懷孕后處死），其余n=10，恢復(fù)期數(shù)據(jù)n=5，**與陰性對(duì)照組相比P＜0.01。

指 標(biāo) 陰性對(duì)照組 受試物高劑量組 受試物中劑量組 受試物低劑量組染毒期腦1.9596±0.1017 1.9000±0.0550 1.9659±0.0828 1.9336±0.1035心臟 0.8420±0.0698 0.7787±0.0445 0.8181±0.1114 0.8172±0.0456肝臟 7.7376±1.0083 6.6085±0.5793** 7.0386±0.7751 7.5695±0.4764腎臟 1.9550±0.1759 1.7629±0.0955** 1.9010±0.2054 1.8582±0.0756腎上腺 0.08648±0.0141 0.0841±0.0177 0.0932±0.0112 0.0857±0.0104胸腺 0.2711±0.1044 0.2366±0.0566 0.2462±0.0552 0.2955±0.0917脾臟 0.6085±0.0994 0.5401±0.0441 0.6444±0.1443 0.6174±0.0748卵巢 0.1482±0.0332 0.1260±0.0245 0.1348±0.0309 0.1347±0.0275子宮 0.5611±0.1518 0.5550±0.1987 0.5754±0.0714 0.4969±0.1037肺臟 1.1944±0.0599 1.2055±0.0665 1.2311±0.1198 1.1848±0.0781恢復(fù)期腦1.9049±0.0539 1.9714±0.0966 1.9839±0.0663 1.9917±0.0821心臟 0.8921±0.0594 0.8901±0.1019 0.9575±0.1078 0.9334±0.0909肝臟 7.6801±0.9590 8.7093±2.2700 7.6818±0.4111 7.9185±0.8986腎臟 1.9902±0.1613 1.9655±0.2397 1.8829±0.0601 1.8907±0.2099腎上腺 0.0848±0.0060 0.0815±0.0065 0.0813±0.0077 0.0838±0.0112胸腺 0.2985±0.0580 0.2904±0.0750 0.2683±0.0482 0.2860±0.0296脾臟 0.6684±0.1021 0.6648±0.0929 0.6210±0.0409 0.6686±0.1465卵巢 0.1319±0.0131 0.1471±0.0361 0.1385±0.0100 0.1569±0.0326子宮 0.4937±0.1556 0.5751±0.1173 0.5635±0.1690 0.5210±0.1137肺臟 1.2952±0.0720 1.2776±0.1715 1.3749±0.0643 1.3142±0.1225

圖3 90 天吸入毒性大鼠部分組織病理切片F(xiàn)ig.3 Pathological section of tissue of rats with 90 days of inhalation

3 討論

本實(shí)驗(yàn)氣溶膠濃度每周測(cè)定1 次，濾膜法采樣后經(jīng)GC-FID 分析，計(jì)算氣溶膠濃度，結(jié)果顯示受試物低、中、高3 個(gè)劑量組氣溶膠濃度分別為（0.24±0.05） mg/L 、（1.74±0.24）mg/L、（14.53±1.07）mg/L，RSD 分別為19%、14%和7%，整個(gè)染毒周期丙三醇?xì)馊苣z濃度的穩(wěn)定性較為可靠，符合吸入毒性試驗(yàn)的設(shè)計(jì)要求[11]。

試驗(yàn)期間，動(dòng)物初次染毒后均有不同例數(shù)動(dòng)物出現(xiàn)眼周及鼻部出血，但于次日染毒前觀察均能恢復(fù)，應(yīng)為應(yīng)激反應(yīng)所致，且組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示眼部和鼻部未見(jiàn)異常，因此，丙三醇的吸入對(duì)鼻部均未產(chǎn)生明顯的異常改變。

與陰性對(duì)照組相比，丙三醇?xì)馊苣z處理組動(dòng)物體重在恢復(fù)期第2 和第3 周，中劑量組雄性大鼠體重有下降趨勢(shì)，但第4 周回復(fù)正常。同時(shí)染毒期間雄性中劑量組和雌性中、高劑量組的攝食量長(zhǎng)期略低于陰性對(duì)照組，但僅有第3、6、11 周出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且未影響動(dòng)物體重，眼科檢查也未見(jiàn)明顯異常，因此認(rèn)為丙三醇?xì)馊苣z對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物的體重、耗食量和眼睛未產(chǎn)生明顯的毒性作用。

與陰性對(duì)照組相比，恢復(fù)期雄性動(dòng)物受試物中劑量組MCH 水平上升（P＜0.05），PLT 水平下降（P＜0.05），但血液學(xué)指標(biāo)的改變是散發(fā)性改變，未見(jiàn)相應(yīng)的生物學(xué)或毒理學(xué)上的病理性變化。

染毒期受試物高劑量組雌性動(dòng)物肝臟重量和腎臟重量均低于陰性對(duì)照組（P ＜0.01），恢復(fù)期受試物中劑量組雄性動(dòng)物肺重量低于陰性對(duì)照組（P＜0.01），但結(jié)合其它劑量組發(fā)現(xiàn)不存在劑量效應(yīng)關(guān)系，同時(shí)上述器官的臟器系數(shù)未發(fā)生顯著性降低，肝臟和肺部組織病理學(xué)檢查也顯示無(wú)明顯病變，因此認(rèn)為丙三醇?xì)馊苣z在試驗(yàn)設(shè)計(jì)劑量下連續(xù)吸入暴露未對(duì)大鼠臟器產(chǎn)生明顯的毒性。

肺泡灌洗液分析主要是根據(jù)肺部支氣管灌洗液可溶性蛋白和細(xì)胞類別的分析，判斷肺部的病變情況[12]。美國(guó)胸科協(xié)會(huì)官方指南界定的健康非吸煙者BALF 細(xì)胞構(gòu)成的參考值范圍為：巨噬細(xì)胞大于85%，淋巴細(xì)胞10%～15%，中性粒細(xì)胞小于或等于3%[13]。在本試驗(yàn)染毒期和恢復(fù)期收集各劑量組的大鼠支氣管肺泡灌洗液，對(duì)灌洗液中的TP、ALP 和LDH 含量及細(xì)胞分類計(jì)數(shù)進(jìn)行分析檢測(cè)，受試物各劑量組與陰性對(duì)照組相比，僅雄性大鼠的LDH、淋巴細(xì)胞和中心粒細(xì)胞比例的均值在染毒期和恢復(fù)期發(fā)生一定程度的升高或降低，但未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且在正常范圍之類，其余指標(biāo)均未見(jiàn)明顯差異，說(shuō)明試驗(yàn)大鼠肺部未出現(xiàn)明顯病變。但馮紅敏等人研究氣管內(nèi)霧化給予體積分?jǐn)?shù)20%丙三醇對(duì)大鼠肺部具有輕微刺激性[14]，Renne 等也發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期低劑量吸入丙三醇對(duì)肺部具有輕微的刺激性[8]，這可能與氣管內(nèi)滴注染毒方式和大鼠的暴露時(shí)間存在差異有關(guān)。在進(jìn)行組織病理學(xué)檢查時(shí)，除陰性對(duì)照組一只動(dòng)物心內(nèi)膜下心肌細(xì)胞壞死，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，其余陰性對(duì)照組及高劑量組受試動(dòng)物心臟和其它剩余器官均未見(jiàn)明顯異常。此例應(yīng)為受試動(dòng)物單發(fā)或偶發(fā)性的背景病變，與受試物毒性無(wú)明顯相關(guān)性。

4 結(jié)論

Wistar 大鼠連續(xù)90 天經(jīng)鼻吸入給予丙三醇?xì)馊苣z，劑量分別為10 mg/kg（受試物低劑量組）、100 mg/kg（受試物中劑量組）、750 mg/kg（受試物高劑量組），恢復(fù)期28 天。在本試驗(yàn)條件下，各受試物組中動(dòng)物體重、耗食量、眼檢、血液學(xué)、血液生化、尿液、臟器重量、臟器系數(shù)、支氣管肺泡灌洗液檢查，均未見(jiàn)與丙三醇相關(guān)的生物學(xué)和毒理學(xué)病變。大鼠鼻吸入丙三醇90 天，暴露劑量750 mg/kg 情況下未對(duì)大鼠產(chǎn)生明顯的毒性作用。