孫雨琦，趙園園，周迪，鐘秋，王俊，周駿，曾代龍，秦艷青，劉德水，楊興有，李晶晶，陳勇，史宏志

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家煙草栽培生理生化研究基地/煙草行業(yè)煙草栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/煙草農(nóng)業(yè)減害研究中心，鄭州市金水區(qū)文化路95號 450002；

2 四川省煙草公司德陽市公司，四川省德陽市什邡回鎮(zhèn)青雀路30號 618400；

3 上海煙草集團(tuán)北京卷煙廠有限公司，北京市通州區(qū)萬盛南街99號 100024；

4 四川中煙工業(yè)有限責(zé)任公司長城雪茄煙廠，四川省德陽市什邡經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)華山路南段128號 618400；

5 中國煙草總公司四川省公司，成都市高新區(qū)世紀(jì)城路936號 600041

煙草特有亞硝胺（tobacco-specifcnitrosamine，TSNA）是煙草生物堿和亞硝酸鹽發(fā)生亞硝化反應(yīng)生成的化合物，在煙葉和煙氣中都有存在，現(xiàn)已證實(shí)的有8 種[4]，其中最主要的4 種為N-亞硝基降煙堿（NNN），4-（甲基亞硝胺）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK），N-亞硝基假木賊堿（NAB）和N-亞硝基新煙堿（NAT）[5]。有研究表明，NNN 和NNK 具有一定的致癌性和致突變性[6-7]。NNK 又被確定為影響卷煙煙氣危害性最重要的7 有害成分指標(biāo)之一[8]。因此認(rèn)為，TSNA 的含量和組成直接影響煙草制品的安全性。史宏志等發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的煙葉樣品中，白肋煙煙葉的TSNAs 含量最高，香料煙次之，烤煙則遠(yuǎn)低于白肋煙和部分香料煙[9]。而目前關(guān)于不同產(chǎn)區(qū)雪茄煙葉TSNAs 含量和雪茄煙安全性的研究較少，摸清國內(nèi)外雪茄煙葉中煙草特有亞硝胺的現(xiàn)狀，對于客觀評價和進(jìn)一步提高雪茄煙葉產(chǎn)品的安全性具有重要意義。

生物堿是形成TSNAs 的主要前體物之一[10]。煙草中生物堿的組成主要有四種，分別為煙堿、降煙堿、新煙草堿和假木賊堿[11]。一般情況下，煙堿占總生物堿含量的94%以上，降煙堿含量低于總生物堿含量的3.5%[12]。然而，煙葉群體中，一些煙株由于發(fā)生基因突變而產(chǎn)生煙堿去甲基能力，導(dǎo)致煙堿轉(zhuǎn)化為降煙堿，造成生物堿組成發(fā)生顯著變化，這不僅影響煙葉的香味品質(zhì)和滿足感，還會因?yàn)榻禑焿A極易與亞硝酸發(fā)生亞硝化反應(yīng)導(dǎo)致亞硝基降煙堿（NNN）和總TSNAs 含量升高[13-15]。關(guān)于煙堿轉(zhuǎn)化方面的研究主要集中在白肋煙上[16-18]，而對于雪茄煙葉生物堿組成的分析及其與煙草特有亞硝胺關(guān)系則鮮有報道。國內(nèi)雪茄煙市場廣闊，但目前仍然處于起步階段[19]。要進(jìn)一步促進(jìn)行業(yè)雪茄煙高質(zhì)量發(fā)展，應(yīng)充分考慮雪茄煙葉優(yōu)質(zhì)和安全問題。本試驗(yàn)系統(tǒng)研究了國內(nèi)外不同產(chǎn)區(qū)雪茄煙葉TSNAs、生物堿的含量并對其相關(guān)性進(jìn)行了分析，這對于明析國內(nèi)外雪茄原料生物堿和TSNAs 的整體水平以及含量差異具有重要意義，以便于后期采取更有針對性的措施降低雪茄煙葉和制品的健康風(fēng)險。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)收集了55 個雪茄煙葉樣品，均為各個產(chǎn)區(qū)主栽品種于2019 年發(fā)酵后的中部葉。試驗(yàn)過程中對樣品進(jìn)行分類，其中按產(chǎn)區(qū)分為中美洲（多米尼加10 個、古巴8 個）、南美洲（巴西7 個）、東南亞（印尼13 個）、中國（四川德陽6 個、四川達(dá)州5 個、海南4 個、湖北來鳳2 個），計(jì)為4 個產(chǎn)區(qū)；按雪茄類型分為茄芯（29 個）、茄衣（13 個）、茄套（13 個），計(jì)為3 種類型。

1.2 化學(xué)分析方法

1.2.1 生物堿測定

采用氣相色譜法，將雪茄煙樣品于50℃烘干后粉碎，過250 μm 篩。每樣品稱取200 mg，煙末置于15 mL 旋蓋培養(yǎng)試管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液（7.5 μg/μL 正十六烷內(nèi)標(biāo)溶液）100 μL，10%NaOH 溶液1.5 mL，甲基叔丁基醚3 mL，旋緊旋蓋，充分振蕩5 min 后，室溫放置（24±2）h 后提取上層清液通過Agilent 7890A 型氣相色譜-氫火焰離子化檢測器（美國Agilent Technologies公司）定量分析4種生物堿（煙堿、降煙堿、假木賊堿、新煙草堿）的含量并以其含量之和作為總生物堿含量。煙堿轉(zhuǎn)化率（%）=［降煙堿含量/（煙堿含量+降煙堿含量）］×100。

1.2.2 TSNAs 測定

雪茄煙樣品中的TSNAs 由上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司北京卷煙廠進(jìn)行測定，采用SPE-液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（SPE-LC-MS/MS）法［SPE-LC：Symbiosis（Pico），Spark Holland（上海儀真分析儀器有限公司）；MS/MS：triplequad5500，ABSciex（上海愛博才思分析儀器貿(mào)易有限公司）］。稱取1.0 g 煙樣，置50 mL 錐形瓶中，加入40 μL 的4 種氘代TSNAs（內(nèi)標(biāo)）溶液（5000 ng/mL）和30 mL 的100 mmol/L乙酸銨水溶液，在室溫下振蕩（200 r/min，萃取60 min），萃取液過0.45 μm 水相濾膜后使用LC-MS/MS 檢測TSNAs 含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），NNN、NNK、NAT 和NAB 含量之和為TSNAs 總量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Excel 2010 對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，運(yùn)用DPS 7.05 進(jìn)行相關(guān)分析，用LSD 法比較均值差異的顯著性，采用Excel 2007 繪圖制表。

2 結(jié)果分析

2.1 雪茄煙生物堿含量及變異

2.1.1 不同產(chǎn)區(qū)雪茄煙生物堿含量狀況及變異分析

從4 個產(chǎn)區(qū)的生物堿含量來看（圖1），國內(nèi)外產(chǎn)區(qū)的樣品均以煙堿含量最高，為0.66%～10.02%，平均值2.69%；假木賊堿含量最低，均在0.07%以下；降煙堿、新煙草堿含量均在0.80%以下；煙堿轉(zhuǎn)化率為2.07%～28.01%，平均值7.66%，變化范圍較廣。

由表1 可知，國內(nèi)外產(chǎn)區(qū)之間的樣品降煙堿含量無顯著差異，國內(nèi)產(chǎn)區(qū)樣品的煙堿和總生物堿含量顯著高于南美洲和東南亞；假木賊堿和新煙草堿含量顯著高于國外3 個產(chǎn)區(qū)；煙堿轉(zhuǎn)化率顯著低于南美洲，但與中美洲、東南亞無顯著差異。除中美洲和東南亞產(chǎn)區(qū)的假木賊堿以外，各個產(chǎn)區(qū)的主要生物堿及總生物堿含量的變異系數(shù)均在40%以上，變異性較大。國內(nèi)外產(chǎn)區(qū)雪茄樣品的煙堿轉(zhuǎn)化率變異系數(shù)均在70%以上，且各個產(chǎn)區(qū)內(nèi)均有煙堿轉(zhuǎn)化率高于15%的雪茄樣品，因此認(rèn)為雪茄煙葉普遍存在煙堿向降煙堿轉(zhuǎn)化的問題。

2.1.2 不同類型雪茄煙生物堿含量狀況及變異分析

按雪茄煙類型對生物堿含量進(jìn)行分析（圖2），茄芯、茄衣、茄套樣品的煙堿含量分別在1.92%～10.02%、0.66%～2.36%、1.03%～2.43%之間，總生物堿含量分別在2.02%～10.90%、0.73%～3.20%、1.30%～2.70%之間，降煙堿、假木賊堿、新煙草堿含量均低于1.00%。各類型雪茄樣品的煙堿轉(zhuǎn)化率在2.07%～28.01%之間，平均值為7.66%。

結(jié)合表2 可知，不同類型雪茄樣品的降煙堿含量無顯著差異，而茄芯樣品的煙堿、假木賊堿、新煙草堿、總生物堿含量均顯著高于茄衣、茄套。茄衣樣品的煙堿轉(zhuǎn)化率顯著高于茄芯、茄套，而茄芯與茄套間的煙堿轉(zhuǎn)化率無差異顯著。三種不同類型雪茄樣品的降煙堿及煙堿轉(zhuǎn)化率變異系數(shù)均在60%以上，煙堿轉(zhuǎn)化率變異幅度較大。

圖1 不同產(chǎn)區(qū)雪茄煙生物堿含量Fig. 1 Contents of alkaloids in cigars from different production areas

表1 不同產(chǎn)區(qū)雪茄樣品生物堿含量變異情況Tab. 1 Variation of alkaloids contents in cigar samples from different production areas

圖2 不同類型雪茄煙生物堿含量Fig. 2 Contents of alkaloids in different types of cigar samples

表2 不同類型雪茄樣品生物堿含量變異情況Tab. 2 Variation of alkaloid content in different types of cigar samples

2.2 雪茄煙TSNAs 含量及變異

2.2.1 不同產(chǎn)區(qū)雪茄煙TSNAs 含量狀況及變異分析從4 個產(chǎn)區(qū)的TSNAs 含量來看（圖3），國內(nèi)外各個產(chǎn)區(qū)樣品NNN 的含量為0.63 μg/g ～20.91 μg/g，平均值為4.06 μg/g；NAT 的含量為范圍在0.21 μg/g ～8.64 μg/g，平均值為1.94 μg/g；NAB 和NNK 的含量均在1.30 μg/g以下；總TSNAs 的含量為1.46 μg/g ～25.75 μg/g，平均值為6.47 μg/g。從TSNAs 組成來看，NNN 和NAT所占TSNAs 的比例相對較高，是TSNAs 中的主要成分。

圖3 不同產(chǎn)區(qū)雪茄煙TSNAs 含量Fig. 3 TSNAs content of cigars from different producing areas

表3 不同產(chǎn)區(qū)雪茄樣品TSNAs 含量變異情況Tab. 3 Variation of TSNAs contents in cigar samples from different production areas μg/g

由表3 可知，國內(nèi)產(chǎn)區(qū)樣品的NNN、NAT、NAB 及總TSNAs 含量顯著低于南美洲，但與中美洲、東南亞無顯著差異。國內(nèi)產(chǎn)區(qū)樣品的NNK 含量顯著低于東南亞，但與中美洲、南美洲無顯著差異。此外，國內(nèi)外各個產(chǎn)區(qū)樣品的NNN、NAT、NAB、NNK 及總TSNAs 含量變異系數(shù)均在45%以上，變異幅度較大。

2.2.2 不同類型雪茄煙TSNAs 含量狀況及變異分析

按雪茄類型對TSNAs 含量進(jìn)行分析（圖4），茄芯、茄衣、茄套樣品的NNN 含量分別在0.63 μg/g～6.52 μg/g、0.66 μg/g～11.95 μg/g、1.02 μg/g～20.91 μg/g 之 間，NAT 含 量 分 別 在0.21 μg/g～5.89 μg/g、0.35 μg/g～8.64 μg/g、0.74 μg/g～4.23 μg/g 之間。從總TSNAs 含量來看，茄芯樣品為1.77 μg/g～10.97 μg/g，平均值4.98 μg/g；茄衣樣品為1.46 μg/g～21.13 μg/g，平均值7.69 μg/g；茄套樣品為2.08 μg/g～25.75 μg/g，平均值8.55 μg/g。

由表4 可知，茄套樣品的NNN 含量顯著高于茄芯樣品，NNK 含量顯著高于茄芯、茄衣樣品；而三種不同類型樣品的NAT、NAB 及總TSNAs 含量均無顯著差異。三種類型雪茄樣品NNN、NAT、NAB、NNK 及總TSNA 含量變異系數(shù)均在45%以上，變異幅度較大。

圖4 不同類型雪茄煙TSNAs 含量Fig. 4 TSNAs content in different types of cigar samples

表4 不同類型雪茄樣品TSNAs 含量變異情況Tab. 4 Variation of TSNAs content in different types of cigar samples μg/g

2.3 雪茄煙TSNAs 與生物堿的關(guān)系

以煙堿轉(zhuǎn)化率5%為分界線，將55 個樣品原料大致分為24 個轉(zhuǎn)化株和31 個非轉(zhuǎn)化株兩部分，分別對其TSNAs 與生物堿含量進(jìn)行相關(guān)性分析（表5），當(dāng)煙堿轉(zhuǎn)化率大于5%或小于5%時，雪茄煙降煙堿與NNN、總TSNAs 均呈顯著正相關(guān)關(guān)系。當(dāng)煙堿轉(zhuǎn)化率小于5%時，煙堿轉(zhuǎn)化率與NNN、總TSNAs 含量無顯著相關(guān)關(guān)系；當(dāng)煙堿轉(zhuǎn)化率大于5%時，煙堿轉(zhuǎn)化率與NNN、總TSNAs 含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，說明煙葉樣本不同可直接影響TSNAs 前體物對TSNAs 形成的貢獻(xiàn)，煙堿轉(zhuǎn)化率較高的煙葉，煙堿轉(zhuǎn)化對TSNAs 形成的貢獻(xiàn)度提高。

3 討論

生物堿是雪茄煙葉核心化學(xué)成分，其組成和含量不僅直接影響雪茄煙葉香味品質(zhì)和生理強(qiáng)度，而且作為煙草中重要的有害物質(zhì)煙草特有亞硝胺合成的前體物，對雪茄煙葉調(diào)制和發(fā)酵過程中煙草特有亞硝胺的形成和積累起重要作用，因此，適宜的生物堿含量水平和合理的生物堿組成是優(yōu)質(zhì)低害雪茄煙葉生產(chǎn)的必然要求。本試驗(yàn)表明，國內(nèi)外不同產(chǎn)區(qū)雪茄煙葉和茄芯、茄衣等不同用途雪茄煙葉生物堿含量樣本間差異性均較大，特別是煙堿、降煙堿含量和煙堿轉(zhuǎn)化率變異性極大，表明雪茄煙葉煙堿向降煙堿轉(zhuǎn)化問題突出。煙堿轉(zhuǎn)化導(dǎo)致煙堿含量異常降低，可顯著影響雪茄煙葉香氣呈現(xiàn)和風(fēng)格特征，降低生理滿足感和醇厚度，同時，由于煙堿去甲基后形成的仲胺類降煙堿極易發(fā)生亞硝化反應(yīng)形成NNN，可造成總TSNAs 水平大幅增加。本研究表明，不同產(chǎn)地和不同用途雪茄煙葉NNN 和總TSNAs 含量的樣本間變異性也均較大，相關(guān)分析表明，降煙堿含量與NNN 和總TSNAs 含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，說明煙堿轉(zhuǎn)化導(dǎo)致的降煙堿含量增加是目前雪茄煙葉NNN 和總TSNA 含量水平增高的主要原因。

表5 不同分類雪茄煙TSNAs 與生物堿的相關(guān)系數(shù)Tab. 5 Correlation coefficient between TSNAs and alkaloid of different cigar samples

煙草特有亞硝胺的合成前體物是生物堿和亞硝酸，這兩類前體物的形成受遺傳、栽培和生態(tài)因素的綜合影響[13]。從本試驗(yàn)結(jié)果看，雖然不同產(chǎn)地雪茄煙葉的生態(tài)條件和栽培技術(shù)有較大差異，但生物堿和煙草特有亞硝胺含量的地區(qū)間差異相對較小，這可能是因?yàn)槟壳安煌a(chǎn)區(qū)和不同用途雪茄煙葉存在的主要問題是煙堿轉(zhuǎn)化性狀的穩(wěn)定性較差，變異性較大，因而掩蓋了生態(tài)條件和栽培管理等方面可能造成的差異，因此，從目前來看，針對煙堿轉(zhuǎn)化性狀對雪茄品種進(jìn)行遺傳改良，對生物堿組成進(jìn)行優(yōu)化，去除轉(zhuǎn)化株，降低群體煙堿轉(zhuǎn)化率是保證和穩(wěn)定生物堿含量水平，降低煙草特有亞硝胺含量的有效途徑和緊迫任務(wù)。在此基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步探究生態(tài)環(huán)境和栽培、調(diào)制技術(shù)與煙草特有亞硝胺形成的關(guān)系，確定雪茄煙葉進(jìn)一步增質(zhì)減害的技術(shù)途徑。此外，本試驗(yàn)對品種分析有一定局限性，因此，可能品種的實(shí)質(zhì)性影響會被掩蓋。下一步我們將在鑒別轉(zhuǎn)化株的基礎(chǔ)上，選用同一品種的非轉(zhuǎn)化株進(jìn)行設(shè)計(jì)，比如用同一品種的非轉(zhuǎn)化株系或同一轉(zhuǎn)化水平的株系在不同生態(tài)區(qū)進(jìn)行種植，這樣可以消除煙堿轉(zhuǎn)化的影響和干擾，更科學(xué)地比較和分析生態(tài)因素對生物堿和TSNAs 的影響，也可進(jìn)一步分析不同用途煙葉的真實(shí)差異。本試驗(yàn)也表明，采用煙堿轉(zhuǎn)化率不同的樣本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)煙堿轉(zhuǎn)化率與TSNA 形成的相關(guān)性不盡相同，表明降煙堿對TSNA 形成的貢獻(xiàn)不同，與Cai 等[20]的研究一致。因此，在解決雪茄煙葉煙堿轉(zhuǎn)化問題后，仍有新的課題值得研究。雪茄煙葉一般采用晾制方式進(jìn)行調(diào)制，而且要需要經(jīng)過獨(dú)特的發(fā)酵過程，關(guān)于煙葉調(diào)制過程中TSNA 的形成機(jī)理目前研究的較為清楚[18,21,22]，但在雪茄煙調(diào)制過程中TSNA 的形成規(guī)律，特別是發(fā)酵過程中TSNA 形成機(jī)理尚需深入研究。

4 結(jié)論

不同產(chǎn)地和不同用途雪茄煙葉生物堿組成和含量、煙堿轉(zhuǎn)化率樣本間差異性均較大，煙堿向降煙堿轉(zhuǎn)化是目前雪茄煙葉存在的突出問題。不同產(chǎn)地和用途雪茄煙葉TSNAs 含量總體較高，樣本間差異和變異性較大，雪茄煙葉降煙堿與NNN 和TSNAs 存在顯著的正相關(guān)關(guān)系。對現(xiàn)有雪茄煙葉品種進(jìn)行改良，優(yōu)化生物堿組成，穩(wěn)定生物堿水平是當(dāng)務(wù)之急，對優(yōu)質(zhì)低害中式雪茄煙葉生產(chǎn)至關(guān)重要。