茅中一 ，周培琛，章雪鋒，張峰，洪祖燦，張曉兵，謝金棟

1 福建中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，福建省廈門市集美區(qū)濱水路298號 361021；

2 廈門大學化學化工學院化學系，福建省廈門市思明南路422號 361005；

3 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號 450001

煙葉致香成分是影響煙葉香型風格質(zhì)量感官評價的重要因素，研究煙葉中致香成分對于揭示煙葉風格質(zhì)量的形成原因具有重要意義[1]。對于煙葉致香成分的研究以往大多是未經(jīng)分離直接進行的全面分析[2]，而經(jīng)分離再分析的報道較少。上世紀80 年代冼可法等[3]采用多種分離、分析技術耦合研究云南煙葉中性香味物質(zhì)，并重組出具有似云煙香的分離組合物，此研究拓寬了分析香型風格及其所含致香成分的思路。

近些年分離、分析新技術發(fā)展迅速，在煙葉致香成分分析領域得到了廣泛使用。如凝膠色譜分離法（GPC）在煙葉關鍵香味成分的感官導向分析已有應用[4-5]，全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜（GC×GC-TOF MS）也應用于煙葉致香成分的分析[6]。雖然已有對煙葉致香成分經(jīng)分離再分析的相關報道[3]，但所用的分離、分析方法均較為傳統(tǒng)，且未與感官評價相結合。目前基于感官輔助GPC 耦合GC×GC-TOF MS 法對煙葉香韻風格及其致香成分分析還鮮有報道。因此，本文以福建尤溪煙葉浸膏為研究對象，采用GPC 分組分離，結合感官評價結果篩選關鍵香韻特征組分，并借助GC×GC-TOF MS 進行定性分析，以期為煙葉香韻風格及其重要致香成分的分析提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：福建尤溪YLC01-2016 煙葉、“七匹狼”參比卷煙（福建中煙工業(yè)有限責任公司提供）。

試劑：95%乙醇、無水乙醇、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷（色譜純，國藥集團化學試劑有限公司），氘代萘、氘代蒽（≥98%，北京百靈威科技有限公司），Sephadex LH-20 填料（美國GE 公司）。

1.2 儀器與設備

LECO Pegasus 4D 全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Leco 公司）；GFL1041 恒溫水浴鍋（德國GFL 公司）；Hei-VAP Precision ML 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國Heidolph 公司）；MP200 中低壓制備色譜（天津博納艾杰爾科技有限公司）；玻璃層析柱（2.6 cm×100 cm）（瑞士Buchi 公司）；CMB120 自動香精香料注射器（意大利G.D.SOCIETA PER AZIONI公司）；AT261 變量程電子天平（瑞士Mettler 公司）。

1.3 方法

1.3.1 提取濃縮方法

取100 g 煙葉，采用1000 g、95%乙醇提取，水浴溫度控制在80℃，提取時間1 h，提取次數(shù)2 次。合并兩次所得煙葉提取液，經(jīng)減壓蒸餾濃縮3 h（體系壓力5～14 kPa，水浴溫度50℃），得到棕褐色的粘稠液體，冷卻后得到浸膏。

1.3.2 分離方法

將4 g 選定的煙葉浸膏溶解于6 mL 無水乙醇中，充分震蕩后過濾，過濾后的樣品進行GPC 分離，柱填料為Sephadex LH-20（填料填充柱長80 cm），以無水乙醇作為流動相，按流速4 mL/min 洗脫，每3 min 收集一個流份。

1.3.3 致香成分的檢測

將目標組分分別減壓濃縮至1.5 mL，加入90 μL氘代萘和氘代蒽作為內(nèi)標（質(zhì)量濃度分別為105.24 μg/mL、83.84 μg/mL），采用GC×GC-TOF MS 檢測，儀器條件如下。

色譜分析條件。色譜柱一：HP-5MS（60 m×0.25 mm，0.25 μm）； 色 譜 柱 二：DB-l7（2.3 m×0.1 mm，0.1 μm）；柱溫程序：50℃（1 min）→3℃/min →220℃→2℃/min →260℃（10 min）；載氣：He；載氣控制方式：恒流，1 mL/min；進樣口溫度：280℃；調(diào)制周期：5 s；進樣量：1 μL；分流模式：分流進樣，分流比10 : 1。

質(zhì)譜條件。離子化方式：EI；離子源溫度：230℃；傳輸線溫度：260℃；EI 電離能量：70 eV；溶劑延遲時間：7 min；掃描模式：全掃描；質(zhì)量掃描范圍：45～450 amu。譜庫檢索采用NIST庫進行檢索，從檢索結果中挑選正向、反向檢索匹配度均大于80%的致香成分。

1.3.4 感官評價方法

由福建中煙技術中心10 名具有省級及省級以上卷煙感官評價資格的評委進行感官評價。嗅辨評價方法參考卷煙中式卷煙風格感官評價方法[7]中嗅香評價方法，對所收集到的流份進行嗅覺特征評價，僅做描述性評價。感官評吸方法為用CMB120 自動香精注射器將樣品按0.01%的比例均勻添加入“七匹狼”參比卷煙中，得到的煙支置于（22±1）℃和RH（60±2）%環(huán)境中平衡48 h，參照YC/T 530—2015 烤煙煙葉質(zhì)量風格特色感官評價方法[8]對參比卷煙及添加了樣品的卷煙進行對比評吸。

2 結果與分析

2.1 感官評價輔助GPC 分組分離

對方法1.3.1所得浸膏按方法1.3.2進行GPC分離，共得到32 個流份，由感官評價人員逐一進行嗅辨評價得到相應的香韻特征，將香韻表現(xiàn)接近的流份合并成7 個組分，各組分再進行嗅辨評價得出評價結果，見表1。其中組分1、7 無明顯的嗅覺特征；組分2～6所表現(xiàn)出的香韻特征各不相同，組分2 的香韻特征是以強烈的清甜香、青滋香為主，帶有花香，干草香，組分3 的頭香是花香、酮甜為主，底部能嗅辯出強烈的干草香，組分4 仍能嗅辯出組分3 的干草香、花香，但從香勢上已減弱，同時底部出現(xiàn)了新香韻特征（焦甜香），與組分4、6 的焦甜香相比，組分5 能嗅辯出更明顯的焦甜香。

表1 各流份按嗅辨評價結果分組情況Tab. 1 The flow was grouped according to the results of sensory evaluation

2.2 組分重組實驗

為驗證GPC 分離后各組分的香韻可重組性，對除無明顯嗅覺特征的組分1、7 外的組分2～6 進行重組實驗，并與浸膏樣品相比較。由表2 可知，簡單的一兩個組分重組無法還原浸膏樣品的香韻風格；組合3的清甜、蜜甜、干草香與浸膏樣品有一定相似，但從整體來看香韻有缺失；組合4、5 與浸膏樣品的相似程度很高，且兩組合間嗅辨出的香韻特征差異不大；組合3、4、5能不同程度地反映了浸膏樣品的香韻特征。

為進一步考察組合后評吸時香韻的變化，對組合3、4、5 進行卷煙加香實驗，并與原煙葉浸膏做對比。由圖1 可得，組合3 在清甜、蜜甜、干草香韻能基本與浸膏樣品相符，但在焦甜香和辛香上有一定損失；組合4、5 的香韻表現(xiàn)很接近，能反映出福建尤溪煙葉的主體香韻特征，但在清甜香上與浸膏樣品仍有一定程度的偏差，同時側(cè)面說明了組分6 對組合5 的整體香韻貢獻度很低。

表2 各組合與浸膏樣品的香韻特征比較結果Tab. 2 Comparison of aroma characteristics between different combinations and extract

圖1 組合3～5 與煙葉浸膏的主要香韻特征評分標度值對比Fig. 1 Comparison of scale values of major aroma characteristic between combination 3～5 and tobacco leaf extract

綜上所述，可根據(jù)實驗結果從GPC 分離所得的7個組分中確定組分2～5 作為浸膏樣品的關鍵香韻特征組分。

2.3 全二維氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析組分2～5致香成分

圖2 組分2～5 各香韻重要致香成分含量分布對比Fig. 2 Comparison of content distribution of important aroma components in group 2～5

通過GC×GC-TOF MS 對組分2～5 的致香成分進行定性分析，其所鑒定出的重要致香成分及其香氣特征如表3 所示，其中香氣特征描述和香韻分類方式主要參考《煙草香原料》《日用調(diào)香術》等文獻[9-11]。組分2、3 中大部分致香成分都帶有清香、青滋香、果香、花香特征，帶有焦甜香、辛香特征的種類和含量都極少。例如組分2 中含有6-甲基-5-庚烯-2-酮、茄酮、香葉基丙酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、巨豆三烯酮、新植二烯等重要清香特征成分；反，反-2，4-己二烯醛、順-3-己烯醛等重要青滋香特征成分；苯乙醇、β-突厥烯酮等重要花香特征成分。與組分2相比，組分3 中清香成分種類明顯減少，且除了二氫獼猴桃內(nèi)酯，巨豆三烯酮A-D 含量顯著增大外，大部分清香特征成分含量顯著下降；青滋香和果香特征成分種類和含量明顯減少；花香特征成分雖然種類有所減少，但β-紫羅蘭酮含量增大，其香氣閾值極低[12]，反而花香更為凸顯。與組分3 相比，組分4 的清香、青滋香、果香、花香特征成分種類和含量均大幅減少，另出現(xiàn)了蜜甜香特征成分如乙酸苯乙酯、苯乙酸乙酯以及一些焦甜香特征成分。組分5 中基本不含清香、青滋香、果香、蜜甜香和花香特征成分，焦甜香特征成分的種類和含量較組分4 均增多；辛香特征成分4-乙烯基愈創(chuàng)木酚以及豆香特征成分如γ-丁內(nèi)酯、香豆素的含量也大大提高。

從圖2 可更直觀的看出組分2～5 各香韻重要致香成分的含量分布變化趨勢。其中清香、青滋香和果香特征成分主要集中在組分2 中，分別占其總含量的78.5%、97.5%和80.6%，與其嗅辨評價結果中強烈的清甜香和青滋香為主相符；花香特征成分主要集中在組分2、3 中，分別占花香成分總含量的43.9%、44.8%，其種類和含量相近，福建尤溪煙葉最主要香韻特征成分都集中在組分2～3 中。焦甜香和辛香特征

成分主要富集在組分4 和5 中，且組分5 的焦甜香特征成分種類和總含量較組分4 顯著增多，這也與組分5 能嗅辨出更明顯的焦甜香相符。綜上分析結果能與嗅辨評價結果相互印證，說明此感官輔助GPC 分離分析方法能不同程度將香韻特征成分有效分組分離集中并分析出重要致香成分。

表3 GC×GC-TOF MS 分析組分2～5 中重要致香成分Tab. 3 Analysis of important aroma components in groups 2～5 by GC×GC-TOF MS μg/g

3 結論

本文采用感官輔助凝膠色譜法與GC×GC-TOF MS 法聯(lián)用分離分析出福建尤溪煙葉香韻風格及其所含的重要致香成分。煙葉提取物經(jīng)感官輔助GPC 分離，能將制備出的流份按香韻特征分為7 個組分，并從中篩選出4 個對香韻風格貢獻度大的關鍵組分，且能按清甜香、干草香和焦甜香等香韻區(qū)分開，較好的反映出福建尤溪煙葉干草香、清甜香突出，蜜甜香明顯，花香微顯的香韻風格。進一步地分析各關鍵組分香韻特征成分，能與文獻[11,13]中所篩查出的煙葉或煙氣香韻特征成分相互印證，且所含香韻特征成分及含量分布與其感官評價結果吻合。