吳怡蓉，謝志剛，鮑濟(jì)波

(昆明醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院種植科，昆明 650000)

纖維蛋白膠(fibrin glue，F(xiàn)G)是在凝血級(jí)聯(lián)的最后一步由凝血酶對(duì)纖維蛋白原作用后形成的天然生物聚合物。1909年，Bergel[1]首次提出了纖維蛋白可以作為止血?jiǎng)┦褂谩?940年，纖維蛋白原被Young和Medawar[2]用作周圍神經(jīng)吻合的黏合劑。1944年，Cronkite等[3]將牛纖維蛋白原和凝血酶混合成FG，用于皮膚移植，這是第一次提到牛凝血酶作為歐洲商業(yè)產(chǎn)品。到了20世紀(jì)70年代，大多數(shù)歐洲產(chǎn)品中都使用了病毒滅活的人凝血酶，1972年，Matras等[4]報(bào)道了用含有濃縮纖維蛋白原的FG進(jìn)行神經(jīng)吻合。1985年，Dresdale等[5]首次描述了用新鮮冰凍血漿和牛凝血酶混合制造FG。20世紀(jì)90年代，非商業(yè)形式的FG在美國應(yīng)用廣泛，直到1998年，商用FG產(chǎn)品第一次被美國食品藥品管理局批準(zhǔn)使用[6]。FG生物相容性、生物可降解性良好，可噴灑或滴注，且具有成膠速度快、易于操作以及粘合力中等的特性。目前，F(xiàn)G除在各類外科手術(shù)中用于局部止血、防止?jié)B透、防止粘連和促進(jìn)愈合外，還可作為緩釋載體和骨移植材料的支架應(yīng)用于骨組織工程[7-11]?，F(xiàn)就FG對(duì)骨再生作用的影響予以綜述。

1 FG的活性成分和成膠機(jī)制

1.1活性成分 FG主要由纖維蛋白原、凝血酶、凝血因子ⅩⅢ和鈣離子等活性成分組成。纖維蛋白原是一種由肝臟合成的具有凝血功能的蛋白質(zhì)，能夠溶解于水，是凝血過程、血栓形成過程中的重要物質(zhì)，相對(duì)分子量約為340 000，呈三聯(lián)球形，由α、β、γ三對(duì)不同的多肽鏈組成，兩端為D區(qū)，中間為E區(qū)，D區(qū)與E區(qū)通過3條呈α螺旋的肽鏈相連(圖1)；凝血酶是從人體或動(dòng)物血液中提取的凝血酶原的蛋白水解酶，直接作用于血液凝固過程的最后一步，促使血漿中的可溶性纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗艿睦w維蛋白，加速傷口表面血液凝固，達(dá)到速效止血的目的，而且還能促進(jìn)上皮細(xì)胞的有絲分裂，加速創(chuàng)傷愈合，是一種速效的局部止血藥[12]。凝血因子ⅩⅢ是血纖維蛋白穩(wěn)定因子，在鈣離子存在的情況下允許纖維蛋白交聯(lián)并形成穩(wěn)定不易碎的凝塊，還可幫助未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞在膠的高度交聯(lián)結(jié)構(gòu)上向外遷移，并促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖[13]。

Aα chain：Aα鏈；Bβ chain：Bβ鏈；γ chain：γ鏈；Central Domain：中心結(jié)構(gòu)域；αC domain：αC 結(jié)構(gòu)域；βC domain：βC 結(jié)構(gòu)域；γC domain：γC 結(jié)構(gòu)域；D Region：D區(qū)；E Region：E區(qū)；Coiled-coil：卷曲螺旋

1.2成膠機(jī)制 將纖維蛋白原、凝血因子ⅩⅢ、凝血酶和鈣離子等混合，模擬血液凝固過程的最后一個(gè)階段，凝血酶斷裂纖維蛋白原的2鏈(Aα,Bβ)而釋放酸性多肽A和B，使纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白單體，而各單體自發(fā)聚集成無橋鍵相連的多聚體；同時(shí)凝血酶激活凝血因子ⅩⅢ，激活的凝血因子ⅩⅢ在鈣離子的作用下催化各纖維蛋白單體間兩條γ鏈的谷氨酰胺殘基和賴氨酸的ε-氨基形成共價(jià)鍵，最終形成穩(wěn)定的纖維蛋白多聚體，呈一種十字交叉、多層、均勻的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能夠網(wǎng)羅住紅細(xì)胞及有效成分，同時(shí)也為成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管的爬行及生長提供了生物支架[14]。

2 FG對(duì)成骨作用的影響

骨組織工程的三大重要組成包括合適的支架、種子細(xì)胞以及生長因子等活性成分。FG具有良好的生物相容性和生物可降解性，在骨再生修復(fù)中得到廣泛應(yīng)用，可以用作支架材料、復(fù)合材料的涂層劑以及細(xì)胞、生長因子、基因、藥物或其他生物活性分子的載體[15-17]。FG中的生長因子可以刺激和促進(jìn)組織修復(fù)，與其他成分(如骨移植材料、成骨細(xì)胞和生物活性分子)聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，可以改善單一材料的物理性能，提高其生物性能，對(duì)骨再生修復(fù)有積極作用。

2.1FG對(duì)細(xì)胞成骨作用的影響 FG可促進(jìn)成骨過程中的成骨細(xì)胞或有成骨潛能的干細(xì)胞增殖、遷移、分化和礦化，為細(xì)胞提供初始基質(zhì)，促進(jìn)骨再生。Rao等[18]用纖維蛋白原和纖維蛋白處理鈦植入物表面，并在體外與人成骨細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)處理的鈦植入物的表面可促進(jìn)更多的細(xì)胞增殖、黏附、基因表達(dá)和礦化?？赡苁抢w維蛋白原和纖維蛋白的加入增強(qiáng)了親水性和細(xì)胞相容性，使它們具有加速骨整合的能力。同時(shí)，有研究表明，在同樣成骨誘導(dǎo)條件下，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和磷酸鹽緩沖液混合相比，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和FG混合誘導(dǎo)了更多的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，獲得了更好的骨再生[19]。另一方面，Woo等[20]觀察到，與未添加FG相比，在硫酸鈣骨水泥中添加FG可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，且進(jìn)一步提高了硫酸鈣骨水泥作為骨移植材料的可行性。另外，F(xiàn)G在骨再生中作為支架、載體或緩釋系統(tǒng)，具有修復(fù)組織的能力。Perumcherry等[21]首次將纖維蛋白均勻電紡成納米纖維，掃描電鏡圖像顯示形成了尺寸為50～500 nm的纖維支架，且該支架支持人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的黏附、擴(kuò)散和增殖。除纖維蛋白納米支架外，還有纖維蛋白納米管和纖維蛋白納米顆粒，可以通過水-肌醇乳化-擴(kuò)散法制備[22]。這些結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出優(yōu)異的抗聚集性和高溫穩(wěn)定性，并具有以可控方式傳遞生長因子和緩慢釋放藥物的能力。Fujioka-Kobayashi等[23]將生長因子人骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)-9加入FG中與成骨細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果顯示，F(xiàn)G有極好的保留人BMP-9的能力，使人BMP-9在10 d內(nèi)逐漸釋放，F(xiàn)G單一成分對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響很小，但與人BMP-9聯(lián)合運(yùn)用后，堿性磷酸酶活性增強(qiáng)，茜素紅染色增多，并且成骨細(xì)胞分化標(biāo)志物堿性磷酸酶、骨唾液蛋白和骨鈣素的信使RNA水平均顯著升高。此外，F(xiàn)G還可作為藥物的緩釋劑。Kim等[24]利用牛骨粉和FG制備了一種載血管緊張素的支架，評(píng)估支架的結(jié)構(gòu)、形態(tài)和力學(xué)性能以及血管緊張素的體外釋放曲線，結(jié)果顯示，骨粉在支架內(nèi)均勻分布，血管緊張素在25 d內(nèi)持續(xù)釋放，且釋放的血管緊張素可刺激細(xì)胞增殖和黏附，無細(xì)胞毒性。綜上，F(xiàn)G與細(xì)胞混合培養(yǎng)時(shí)表現(xiàn)出良好的生物相容性，不會(huì)引起炎癥反應(yīng)，與細(xì)胞、骨移植材料和(或)生物活性分子聯(lián)合運(yùn)用，能夠促進(jìn)有成骨潛能的細(xì)胞黏附、增殖、遷移和分化，使生物活性分子緩慢釋放，延長作用時(shí)間，促進(jìn)骨再生。

2.2FG植入動(dòng)物體內(nèi)后對(duì)成骨作用的影響 FG具有良好的生物學(xué)性能，常與細(xì)胞、骨移植材料和生長因子等復(fù)合后植入骨缺損的動(dòng)物模型，作為細(xì)胞和生長因子的載體，提高細(xì)胞接種效率，減少顆粒狀骨移植材料的移位，加速骨組織的愈合。Park等[25]將包埋人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或牙囊間充質(zhì)干細(xì)胞的FG注入脫鈣骨基質(zhì)支架中，然后植入裸鼠皮下進(jìn)行體內(nèi)成骨實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和牙囊間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨能力以及FG作為細(xì)胞載體的可行性。同樣，Seebach等[26]的研究證實(shí)了FG對(duì)大鼠股骨缺損植入間充質(zhì)干細(xì)胞的早期作用，如宿主細(xì)胞的募集、早期炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、新血管的形成和骨組織再生等，F(xiàn)G可作為一種良好的載體用于組織工程。研究人員還將骨移植材料和(或)生物活性分子與FG混合，以達(dá)到加速骨修復(fù)的目的。例如，Cassaro等[27]研究了FG、雙相磷酸鈣和間充質(zhì)干細(xì)胞在大鼠股骨缺損中的聯(lián)合再生能力，結(jié)果表明，F(xiàn)G有利于優(yōu)化手術(shù)過程，并且可以促進(jìn)細(xì)胞黏附和增殖，是一種適合于骨缺損的支架材料。van der Stok等[28]用負(fù)載BMP-2的FG填充多孔鈦植入物，并將該生物材料用于修復(fù)大鼠股骨節(jié)段性骨缺損，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在單純鈦植入物及FG填充的鈦植入物填充缺損的對(duì)照組中骨再生沒有發(fā)生，換言之，F(xiàn)G本身并不能提高鈦植入物的骨再生潛能，而是作為BMP-2的載體，改善了骨修復(fù)過程。而Zhang等[29]則發(fā)現(xiàn)，將血管內(nèi)皮生長因子/聚乳酸-乙醇酸/FG輸送到犬股骨缺損處，可以顯著改善血管重建以及骨愈合的質(zhì)量和速度。同樣，Vila等[30]將纖維蛋白與血小板衍生生長因子和BMP-2混合后植入小鼠顱骨缺損處，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，纖維蛋白介導(dǎo)的血小板衍生生長因子和BMP-2可改善血管生成，使血管更加豐富和粗大，可誘導(dǎo)更多的骨形成。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，將以FG/纖維連接蛋白/肝素為基礎(chǔ)的BMP-2給藥系統(tǒng)植入大鼠顱骨缺損處后，BMP-2可穩(wěn)定釋放，給藥系統(tǒng)可顯著促進(jìn)大鼠顱骨缺損模型的骨再生，表明FG可作為理想的緩釋劑應(yīng)用于組織工程[31]。此外，F(xiàn)G還可用于基因治療，Li等[32]將聚丙交酯-乙交酯/FG負(fù)載脂質(zhì)體/pDNA-轉(zhuǎn)化生長因子-β1與間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合組作為實(shí)驗(yàn)組，將無纖維蛋白組作為對(duì)照組，其中聚丙交酯-乙交酯/FG復(fù)合物充當(dāng)軟骨形成的支架，基因復(fù)合物脂質(zhì)體/pDNA-轉(zhuǎn)化生長因子-β1均勻地分布于復(fù)合支架中，F(xiàn)G使基因緩慢釋放，且FG包裹骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，有助于提高復(fù)合支架中的細(xì)胞負(fù)載密度；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)化生長因子-β1的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組治療12周后，與正常軟骨組織相似的新組織修復(fù)軟骨全層缺損。這些研究均證實(shí)了FG植入動(dòng)物體內(nèi)后對(duì)成骨作用的積極影響。

但也有少量研究報(bào)道了FG在骨再生方面的負(fù)面影響。例如，Gerngross等[33]發(fā)現(xiàn)，在自體松質(zhì)骨移植上添加FG，對(duì)綿羊模型脛骨皮質(zhì)骨重建有負(fù)面影響。Lappalainen等[34]也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)G與自體顆粒骨在修復(fù)兔顱骨缺損中可延遲骨礦化，但愈合情況仍優(yōu)于未植入任何材料的陰性空白對(duì)照組。分析副作用的原因可能是FG限制了血管在移植骨中的生長方面的潛在作用，或者FG作為一種空隙填充物阻止了天然纖維蛋白的形成。同樣，Carmagnola等[35]指出，在Bio-Oss顆粒中添加FG可使犬下頜骨缺損的骨與生物材料之間的組織接觸減少，與Bio-Oss單獨(dú)治療組相比，在Bio-Oss/FG治療組的骨缺損中未觀察到新骨形成，F(xiàn)G破壞了生物骨顆粒與骨組織的結(jié)合。還有學(xué)者指出，高濃度的纖維蛋白原(35～55 mg/mL)可能會(huì)阻礙細(xì)胞長入骨缺損處，導(dǎo)致骨愈合延遲[36]。

綜上，F(xiàn)G用于動(dòng)物體內(nèi)成骨時(shí)延遲骨愈合的原因，可能是FG用量不恰當(dāng)或各組分的濃度不合適，導(dǎo)致骨組織與生物材料間的接觸減少，妨礙了生物骨顆粒與骨組織的結(jié)合或者限制了新生血管的長入。但是，F(xiàn)G聯(lián)合其他骨移植材料植入骨缺損區(qū)，并選擇合適的用量及配比，可以改善新生血管形成、提高骨愈合能力。因此，需要進(jìn)一步研究FG的最適用量及各組分的濃度后，再植入FG與骨移植材料復(fù)合物，才能改善骨再生，加速骨愈合，否則可能適得其反。

3 FG對(duì)人口腔頜面部骨再生的影響

雖然FG植入動(dòng)物體內(nèi)改善骨愈合的觀點(diǎn)尚無定論，但仍有FG作為黏合劑、緩釋劑和支架與不同骨移植材料聯(lián)合應(yīng)用于骨增量手術(shù)的報(bào)道。單獨(dú)運(yùn)用FG時(shí)，由于機(jī)械強(qiáng)度較差以及降解速度與骨再生速度不完全匹配，故不足以維持骨再生過程中所需的空間。臨床上多將FG加入其他骨移植材料用于骨增量手術(shù)，這樣既保持了骨移植材料的骨傳導(dǎo)和空間維持作用，又能使FG充分發(fā)揮緩慢釋放生長因子及促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用，進(jìn)而改善骨愈合，增強(qiáng)骨再生。將FG與骨移植材料聯(lián)合運(yùn)用，證實(shí)了加入FG后的骨移植材料更易于臨床操作，且不容易移位[37-38]。FG作為顆粒狀骨移植材料之間的生物連接物，將顆粒黏合在一起，可提高臨床操作效率，而且纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)能促進(jìn)細(xì)胞遷移，這是新生血管形成、血管化和移植材料成骨所必需的。Giannini等[39]將5例使用自體骨碎片和纖維蛋白血小板膠混合物行骨重建手術(shù)患者的結(jié)果與20例具有相同手術(shù)指征未使用纖維蛋白血小板膠患者的結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果表明，自體骨碎片和纖維蛋白血小板膠的混合物有利于改善骨再生，減少感染，且可縮短住院時(shí)間。Tayapongsak等[40]指出，使用自體FG治療人下頜骨缺損，加速了血運(yùn)重建，并刺激了成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞的生長。Segura-Castillo等[41]也發(fā)現(xiàn)，在治療牙槽裂時(shí)使用FG，移植骨吸收顯著減少，F(xiàn)G在移植材料與正常骨之間形成橋，通過促進(jìn)細(xì)胞遷移改善移植材料的整合。因自體骨移植應(yīng)用具有局限性，出現(xiàn)了其他骨替代材料與FG聯(lián)合應(yīng)用的情況。例如，Reppenhagen等[42]使用雙相陶瓷(60%羥基磷灰石和40%β-磷酸三鈣)結(jié)合FG，對(duì)51例良性骨腫瘤或腫瘤樣病變刮除后的缺損進(jìn)行修復(fù)，結(jié)果50例患者在56個(gè)月后骨缺損均完全愈合，且術(shù)后未見骨折，組織學(xué)分析顯示新骨形成，表明植入材料具有良好的生物相容性和骨整合性，雙相陶瓷結(jié)合FG是一種有效的骨移植替代物，可降低供區(qū)并發(fā)癥的發(fā)生率。同時(shí)，有學(xué)者將自體細(xì)胞加載到FG復(fù)合的陶瓷顆粒上，治療8例低位肱骨近端骨折患者，治療期間無不良反應(yīng)，12個(gè)月后對(duì)修復(fù)組織進(jìn)行活檢，發(fā)現(xiàn)骨形成，表明復(fù)合材料有良好的生物相容性[43]。此外，F(xiàn)G還可將抗生素高效輸送至所需位置。Tofuku等[44]報(bào)道指出，使用FG包裹的抗生素，可顯著降低接受骨科手術(shù)患者深部手術(shù)部位感染的發(fā)生率，在未使用FG治療的188例患者中有11例患者深部手術(shù)部位感染，而在196例使用FG包裹抗生素的患者中無一例深部手術(shù)部位感染。這可能是由于FG作為緩釋系統(tǒng)使抗生素緩慢釋放，延長了抗生素的作用時(shí)間。

近年來，將黏性骨應(yīng)用于臨床骨增量手術(shù)，并取得了良好的成骨效果。黏性骨是自體FG和骨移植材料的混合物，術(shù)中易于操作，可以塑造成所需的形狀，防止骨移植材料分散，而且自體FG富含各種生長因子，十分有利于骨再生；另外，黏性骨還可以在不使用任何骨釘或鈦網(wǎng)的情況下，將移植材料穩(wěn)定到骨缺損處，從而加速骨組織愈合[45]。Joshi等[46]用異體牙顆粒聯(lián)合自體FG治療上頜右尖牙區(qū)牙槽嵴缺損，臨床和放射學(xué)結(jié)果均證實(shí)，牙槽骨寬度和高度有顯著增加。在另一項(xiàng)研究中，Dhanaraj[47]用自體FG和異質(zhì)骨混合成黏性骨，并將黏性骨置于去除的舊種植體與新植入種植體之間的骨缺損處，治療期間因植入物壓迫引起了下頜神經(jīng)疼痛，結(jié)果術(shù)后1個(gè)月疼痛完全消失，6個(gè)月后行種植義齒修復(fù)效果良好，表明黏性骨可以促進(jìn)新骨的形成，對(duì)組織愈合產(chǎn)生積極作用。因此，臨床上可將FG與其他骨移植材料聯(lián)合應(yīng)用于骨增量手術(shù)，既可縮短臨床操作時(shí)間，穩(wěn)定骨移植材料，又可為細(xì)胞遷移提供支架，使生長因子緩慢釋放，加速新生血管形成的同時(shí)促進(jìn)骨再生，為骨組織工程提供了一種更有效的骨移植材料。

4 小 結(jié)

FG在骨形成過程中具有促進(jìn)細(xì)胞遷移、增殖、分化和礦化的作用。然而，F(xiàn)G單一成分對(duì)成骨作用不顯著，往往需要聯(lián)合其他骨移植材料和(或)生物活性分子，作為支架、傳遞系統(tǒng)和(或)緩釋劑運(yùn)用于骨組織工程。這種組合可以改善單一材料的物理性能，使生長因子緩慢釋放，促進(jìn)新生血管的形成和骨組織的愈合。臨床應(yīng)用時(shí)還能將骨移植材料穩(wěn)定在骨缺損處，縮短操作時(shí)間，獲得良好的成骨效果。在未來，F(xiàn)G還有很大的發(fā)掘空間，纖維蛋白原和凝血酶作為FG的重要活性成分，其最佳作用濃度以及FG與其他生物材料或生物活性分子的最佳運(yùn)用配比，仍需深入研究。