王孟君，劉從會，張娟，尹紅

(安康市中心醫(yī)院婦科，陜西 安康 725000)

子宮內(nèi)膜癌是女性常見的惡性腫瘤之一，在生殖系惡性腫瘤中排名第二，僅次于子宮頸癌，近年來有上升趨勢且年輕化，引起臨床工作者和科研工作者的重視[1-2]。目前手術(shù)仍是子宮內(nèi)膜癌的主要治療方式，其他單純放化療及激素治療效果欠佳，分子診療仍無明顯進(jìn)展[3-4]。染色體空間重組因子1(remodeling and spacing factor-1,Rsf-1；又名hepatitis BX-antigen associated protein,HBXAP)是人類核心組蛋白及染色質(zhì)組裝相關(guān)因子家族重要成員之一，位于人染色體11q13.5上，最早在人HeLa細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)，是人體腫瘤最常見擴(kuò)增區(qū)域之一[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Rsf-1/HBXAP在乳腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、胃癌及肺癌等惡性腫瘤中均高表達(dá)，多以“促癌基因”角色參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[6-7]。但目前關(guān)于其與子宮內(nèi)膜癌的研究較少見。本研究通過免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測子宮內(nèi)膜癌組織和細(xì)胞中Rsf-1/HBXAP表達(dá)情況，利用小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默Rsf-1/HBXAP并探討其對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年2月至2018年3月安康市中心醫(yī)院收治的80例子宮內(nèi)膜癌患者作為研究對象，年齡25～68歲，TNM分期Ⅰ～Ⅱb期，患者均行手術(shù)治療，且病理結(jié)果確診為子宮內(nèi)膜癌，病理科保存有癌組織和癌旁正常組織蠟塊者；排除合并其他惡性腫瘤者。本研究通過安康市中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署了知情同意書。

1.2試劑與儀器 子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa細(xì)胞和HEC-1-A細(xì)胞均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院生化細(xì)胞所，脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Applied BiosystemsTMSYBRTMGreen試劑盒均購自美國Thermo Fisher Scientific公司(批號：4368702)；Rsf-1/HBXAP、兔抗人單克隆抗體和鼠抗兔二抗均購自美國Abcam公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting Kit-8,CCK-8)和細(xì)胞凋亡試劑盒購自美國ABI公司(批號：EC008)；Transwell小室購自美國BD公司；Rsf-1/HBXAP引物及對應(yīng)siRNA均由山東維真生物科技有限公司完成。Light Cycle PCR儀購自瑞士Roche公司；IX51型號倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；CytoFLEX流式細(xì)胞儀購自美國Beckman公司。

1.3方法

1.3.1IHC檢測Rsf-1/HBXAP蛋白表達(dá) 從石蠟包塊中切取組織切片，并嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行脫蠟、水化、抗原修復(fù)、添加一抗(1∶300)、添加二抗、二氨基聯(lián)苯胺染色、復(fù)染、脫水、透明及封片，最后由兩名高級病理科醫(yī)師進(jìn)行鏡檢判斷(始終保持雙盲原則)。判斷方法：由以上醫(yī)師在每張玻片上選取具有代表性的5個(gè)高倍鏡視野進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)，Rsf-1/HBXAP蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)，腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色為陽性細(xì)胞，根據(jù)著色強(qiáng)度不同記分：棕褐色3分、棕黃色2分、淡棕黃色1分和無著色0分；根據(jù)著色細(xì)胞數(shù)不同記分：無陽性細(xì)胞0分、≤10% 1分、11%～50% 2分、51%～75% 3分和>75% 4分；將著色強(qiáng)度計(jì)分和著色細(xì)胞數(shù)計(jì)分相乘>3分者為陽性，陽性率=陽性例數(shù)/總例數(shù)×100%[8]。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng) Ishikawa細(xì)胞和HEC-1-A細(xì)胞均接種于10%胎牛血清-高糖杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基上，并于5% CO2、37 ℃、飽和濕度培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.3qRT-PCR檢測Rsf-1/HBXAP mRNA表達(dá) 取對數(shù)生長期子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞和HEC-1-A細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/L，取1 mL細(xì)胞重懸液檢測Rsf-1/HBXAP mRNA，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行總RNA提取、cDNA制備和qRT-PCR，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為參考基因，分析Rsf-1/HBXAP mRNA相對表達(dá)水平(2-ΔΔCt，ΔCt=Rsf-1/HBXAPCt-GAPDHCt)，其中Rsf-1/HBXAP上游引物為5′-G ATACTATGCGTCTCCAGCCAA-3′,下游引物為5′-CAACTCGTGTTTCGATTTCTGACAA-3′。選取Rsf-1/HBXAP mRNA含量高的子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4細(xì)胞分組和siRNA轉(zhuǎn)染 將Ishikawa細(xì)胞共分為3組[9]：siRNA-Rsf-1/HBXAP組、陰性對照組和空白對照組，其中siRNA-Rsf-1/HBXAP組轉(zhuǎn)染Rsf-1/HBXAP-siRNA，陰性對照組轉(zhuǎn)染陰性對照-siRNA，空白對照組轉(zhuǎn)染等量0.9%氯化鈉溶液，轉(zhuǎn)染具體步驟參照脂質(zhì)體Lipofectamine 2000試劑說明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染完成后繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況，并用qRT-PCR檢測各組細(xì)胞Rsf-1/HBXAP mRNA表達(dá)水平以確認(rèn)轉(zhuǎn)染是否成功。

1.3.5CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 分別取轉(zhuǎn)染完成后第1天、第3天和第5天對數(shù)生長期的siRNA-Rsf-1/HBXAP組、陰性對照組和空白對照組細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞重懸，并調(diào)整其密度，后將其置于96孔板上，保證每孔1×103個(gè)，嚴(yán)格按照說明書向每孔中添加10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后將其置于酶標(biāo)儀450 nm處檢測各孔吸光度值(optical density，OD)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 分別取轉(zhuǎn)染完成后第1天、第3天和第5天對數(shù)生長期的siRNA-Rsf-1/HBXAP組、陰性對照組和空白對照組細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞重懸，并調(diào)整其密度，后將其置于96孔板上，保證每孔1×105個(gè)，繼續(xù)培養(yǎng)待細(xì)胞融合度為80%時(shí)參照操作說明書分別添加碘化丙啶和膜聯(lián)蛋白進(jìn)行染色(標(biāo)記熒光素異硫氰酸熒光素)，1 h后將其置于流式細(xì)胞儀中進(jìn)行檢測并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.7Transwell法檢測細(xì)胞侵襲 分別取轉(zhuǎn)染完成后第1天、第3天和第5天對數(shù)生長期的siRNA-Rsf-1/HBXAP組、陰性對照組和空白對照組細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞重懸，并調(diào)整其密度為1×108個(gè)/L，將100 μL細(xì)胞置于Transwell小室上層(不含基質(zhì)膠)，將500 μL杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基溶液(含20%胎牛血清)置于Transwell小室下層，繼續(xù)培養(yǎng)2 d，用棉簽?zāi)ㄈバ∈疑蠈蛹?xì)胞后將其固定，緩沖液洗滌后用0.1%結(jié)晶紫染色，后于倒置顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取平均值為最終結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1子宮內(nèi)膜癌癌組織和癌旁正常組織中Rsf-1/HBXAP蛋白比較 子宮內(nèi)膜癌癌組織Rsf-1/HBXAP蛋白陽性率高于癌旁正常組織[77.50%(62/80)比18.75%(15/80)](χ2=55.303，P<0.001)。見圖1。

2.2不同子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Rsf-1/HBXAP mRNA比較 子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞和HEC-1-A細(xì)胞Rsf-1/HBXAP mRNA表達(dá)水平分別為1.34±0.16和1.02±0.28，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.923,P<0.001)。

1a:子宮內(nèi)膜癌癌組織Rsf-1/HBXAP蛋白陽性；1b：子宮內(nèi)膜癌癌組織Rsf-1/HBXAP蛋白陰性

2.3各組細(xì)胞Rsf-1/HBXAP mRNA比較 siRNA-Rsf-1/HBXAP組、陰性對照組和空白對照組細(xì)胞Rsf-1/HBXAP mRNA分別為0.22±0.04、1.37±0.17和1.30±0.15，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=103.482,P<0.001)，其中siRNA-Rsf-1/HBXAP組低于陰性對照組和空白對照組(P<0.01)，說明轉(zhuǎn)染成功，轉(zhuǎn)染72 h后各組熒光顯微鏡下圖見圖2。

2.4沉默Rsf-1/HBXAP對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的影響 第1天、第3天、第5天細(xì)胞OD值的主效應(yīng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不考慮測量時(shí)間，各組間細(xì)胞OD值的主效應(yīng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；細(xì)胞OD值的組間和時(shí)點(diǎn)間存在交互作用(P<0.05)，各組第3天、第5天細(xì)胞OD值呈升高趨勢，siRNA-Rsf-1/HBXAP組各時(shí)點(diǎn)間OD值低于空白對照組和陰性對照組(P<0.05)。見表1。

2.5沉默Rsf-1/HBXAP對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡的影響 第1天、第3天、第5天細(xì)胞凋亡率的主效應(yīng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不考慮測量時(shí)間，各組間細(xì)胞凋亡率的主效應(yīng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；細(xì)胞凋亡率的組間和時(shí)點(diǎn)間存在交互作用(P<0.05)，空白對照組和陰性對照組第3天、第5天的細(xì)胞凋亡率呈下降趨勢，siRNA-Rsf-1/HBXAP組呈升高趨勢，siRNA-Rsf-1/HBXAP組各時(shí)點(diǎn)間細(xì)胞凋亡率均高于空白對照組和陰性對照組(P<0.05)。見表2。

siRNA:小干擾RNA；Rsf-1/HBXAP:染色體空間重組因子1

表1 各組細(xì)胞OD值比較

表2 各組細(xì)胞凋亡率比較

2.6沉默Rsf-1/HBXAP對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲的影響 第1天、第3天、第5天侵襲細(xì)胞數(shù)的主效應(yīng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不考慮測量時(shí)間，各組間侵襲細(xì)胞數(shù)的主效應(yīng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；侵襲細(xì)胞數(shù)的組間和時(shí)點(diǎn)間存在交互作用(P<0.05)，空白對照組和陰性對照組第3天、第5天的侵襲細(xì)胞數(shù)呈升高趨勢，siRNA-Rsf-1/HBXAP組呈下降趨勢，siRNA-Rsf-1/HBXAP組各時(shí)點(diǎn)間侵襲細(xì)胞數(shù)均低于空白對照組和陰性對照組(P<0.05)。見表3。

表3 各組侵襲細(xì)胞數(shù)比較 (n=3,個(gè),

3 討 論

近年來，隨著分子生物技術(shù)的不斷進(jìn)步，學(xué)者們對子宮內(nèi)膜癌的分子機(jī)制研究逐漸增多，其發(fā)生、發(fā)展是多基因改變和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異?；ハ嘧饔玫膹?fù)雜連鎖過程，但仍未明確可服務(wù)臨床的有效標(biāo)志物[10-11]。Rsf-1/HBXAP最早于HeLa細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)，隨后在人類各腫瘤組織中均有報(bào)道，且多高表達(dá)，是近年來發(fā)現(xiàn)的新型腫瘤標(biāo)志物之一[12-13]。Rsf是一種復(fù)合物，包括Rsf-1和人類不發(fā)酵蔗糖蛋白2同源物兩種亞型，且均定位于細(xì)胞核，可調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)以適應(yīng)各種生長信號和環(huán)境變化需求，若Rsf異常升高可導(dǎo)致細(xì)胞在基因水平上失去對細(xì)胞生長的正常調(diào)控而出現(xiàn)異常增生，進(jìn)而形成局部腫塊[14-15]。目前研究提示，Rsf-1主要作為一個(gè)致癌基因參與細(xì)胞增殖及惡性轉(zhuǎn)化過程，這是因?yàn)槠淇膳c人類不發(fā)酵蔗糖蛋白2同源物在細(xì)胞核內(nèi)結(jié)合成染色質(zhì)重塑復(fù)合物Rsf，以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的修復(fù)與重構(gòu)，從而逃避死亡，Rsf-1還與腫瘤細(xì)胞增殖能力、侵襲能力、惡性程度、耐藥及染色體穩(wěn)定性相關(guān)[16-17]。Choi等[18]在卵巢癌研究中發(fā)現(xiàn)Rsf-1/HBXAP可通過與細(xì)胞周期蛋白E結(jié)合促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。Liu等[19]在乳腺癌研究中發(fā)現(xiàn)干擾Rsf-1表達(dá)能有效抑制乳腺癌MCF-7和SKBR-3細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，有望成為乳腺癌治療的新靶點(diǎn)。Wang等[20]通過IHC、Kaplan-Meier分析及siRNA等方法發(fā)現(xiàn)RSF-1參與宮頸癌的腫瘤進(jìn)展，可作為癌癥發(fā)展和臨床結(jié)局的早期預(yù)后指標(biāo)，且認(rèn)為抗RSF-1活性治療對RSF-1過表達(dá)宮頸癌患者有益。

在本研究中，通過IHC檢測發(fā)現(xiàn)Rsf-1/HBXAP蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中陽性率顯著高于癌旁正常組織，提示Rsf-1/HBXAP主要作為一個(gè)癌基因存在于子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，以促進(jìn)其發(fā)生發(fā)展，為后續(xù)研究提供了臨床理論基礎(chǔ)。目前，已有大量研究證明Rsf-1/HBXAP可提高腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲能力，并同時(shí)抑制其凋亡能力，使用Rsf-1/HBXAP拮抗劑或Rsf-1/HBXAP-siRNA可幫助抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡[21-22]。本研究采用qRT-PCR法選取較高表達(dá)Rsf-1/HBXAP的Ishikawa細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)探討，并通過siRNA介導(dǎo)沉默Rsf-1/HBXAP以分析其對子宮內(nèi)膜癌生物學(xué)功能的影響，結(jié)果顯示，空白對照組和陰性對照組細(xì)胞增殖、侵襲能力比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，排除了轉(zhuǎn)染本身對癌細(xì)胞的影響；siRNA-Rsf-1/HBXAP組水平最弱，提示沉默Rsf-1/HBXAP可明顯抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖和侵襲能力。而在細(xì)胞凋亡能力上，siRNA-Rsf-1/HBXAP組水平最強(qiáng)，提示Rsf-1/HBXAP在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定作用，為其診療提供了一個(gè)新的方向，是本研究重要?jiǎng)?chuàng)新之處。

綜上所述，Rsf-1/HBXAP在子宮內(nèi)膜癌中高表達(dá)，沉默Rsf-1/HBXAP在降低癌細(xì)胞增殖及侵襲能力的同時(shí)可增強(qiáng)其凋亡能力，但具體作用機(jī)制尚不清楚，有待后續(xù)探討。