李萍，劉怡茜

南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 腫瘤科，南京 210009

胰腺癌是一種病死率高、生存期短的惡性腫瘤。2020年美國胰腺癌新發(fā)病例為57 600例，死亡病例為47 050例，占癌癥導致的死亡原因的第四位，5年生存率在所有腫瘤中最低（9%）[1]。2019年中國最新癌癥報告顯示，胰腺癌發(fā)病和死亡均位居惡性腫瘤前十位。無疑，胰腺癌已日益成為危害人類健康的重大疾病。

細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）由基底膜和細胞間質(zhì)組成，一直以來被認為與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等多種生物過程密切相關。Ⅴ型膠原蛋白α2（COL5A2）是ECM的主要成分之一。相關研究及數(shù)據(jù)分析表明，COL5A2參與多種惡性腫瘤的病理過程，且與患者的預后密切相關，包括舌鱗癌[2]、乳腺癌[3]、結(jié)直腸癌[4]、膀胱癌[5-6]和卵巢癌[7]等。目前國內(nèi)外有關COL5A2與胰腺癌的研究尚少，僅局限于Zhou等[8]通過整合轉(zhuǎn)錄組分析中發(fā)現(xiàn)的關鍵基因（hub genes）。

Oncomine數(shù)據(jù)庫是目前全球最大的癌基因芯片數(shù)據(jù)庫和整合數(shù)據(jù)挖掘平臺，其宗旨在于挖掘癌癥基因信息，目前已收錄包括715個基因表達數(shù)據(jù)集、86 733個癌癥組織和正常組織在內(nèi)的樣本數(shù)據(jù)。Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫[9]是目前分析預后應用較廣泛的在線數(shù)據(jù)庫，涵蓋了包括胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌等在內(nèi)的21種腫瘤類型，可對54 000個基因進行包括總生存、無復發(fā)生存、無進展生存等在內(nèi)的相關預后分析，結(jié)果較為客觀。本研究主要采用Oncomine數(shù)據(jù)庫和Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析COL5A2在胰腺癌中的表達及其與預后的關系，為進一步闡明胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展機制提供線索。

1 資料與方法

1.1 從Oncomine數(shù)據(jù)庫中提取數(shù)據(jù)

根據(jù)本研究需求，在Oncomine數(shù)據(jù)庫（https://www.oncomine.org/resource/login.html）中 設 定 篩 選和挖掘數(shù)據(jù)的條件：①cancer type：pancreatic cancer；②gene：COL5A2；③data type：mRNA；④analysis type：cancer vs normal analysis；⑤臨界值設定條件：P＜0.05，fold change＞2，gene rank=All。

1.2 從NCBI/GEO Profiles數(shù)據(jù)庫中提取數(shù)據(jù)

根據(jù)本研究需求，在NCBI網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）篩選挖掘數(shù)據(jù)：①GEO profiles；②輸入關鍵詞：COL5A2 and pancreatic cancer；

1.3 Kaplan-Meier Plotter生存分析

利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫（http：//kmplot.com/analysis/）中的Pan cancer（mRNA）數(shù)據(jù)集進行生存分析。篩選條件：①Gene symbol：COL5A2；②Split patients by：Auto select best cutoff；③Survival：OS/RFS；④Follow up threshold：All；⑤Cancer：Pancreatic ductal adenocarcinoma（n=177）。本研究預后評價指標包括總生存期（overall survival，OS）和無復發(fā)生存期（relapse-freesurvival，RFS）。OS定義為癌癥診斷之日起至因任何原因引起死亡的時間。RFS定義為從癌癥初次治療至最早出現(xiàn)局部復發(fā)、遠處轉(zhuǎn)移或死亡的時間。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫和Graphpad Prism 5統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。采用x±s描述COL5A2基因的表達量，其在正常組織與胰腺癌組織的差異分析采用獨立樣本t檢驗。采用Kaplan-Meier法分析COL5A2表達與胰腺癌預后的關系，組間比較用Log-rank檢驗。雙側(cè)P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 COL5A2在常見腫瘤類型中的表達

Oncomine數(shù)據(jù)庫共收集了417項不同類型腫瘤組織與正常組織中COL5A2的比較研究結(jié)果，其中COL5A2表達差異有統(tǒng)計學意義的78項，包括高表達的研究75項、低表達的研究3項（圖1）。

2.2 COL5A2在胰腺癌組織中的表達

2003年以來，Oncomine數(shù)據(jù)庫中共有7項芯片研究比較COL5A2在胰腺癌組織及正常組織中的表達，共178個樣本（圖2）[10-16]。在Oncomine數(shù)據(jù)庫中對上述7項研究結(jié)果進行薈萃分析發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，所有差異表達基因中COL5A2中位數(shù)值排名為790，并在胰腺癌組織中呈高表達（P=0.008）。

2.3 COL5A2在不同胰腺癌研究芯片中的表達

Oncomine數(shù)據(jù)庫中COL5A2在不同胰腺癌研究芯片中的表達情況如圖3a～g所示。在Oncomine數(shù)據(jù)庫的7項研究中，有5項揭示COL5A2在胰腺癌組織中的表達量明顯高于正常組織（P＜0.05，F(xiàn)old change＞2），分別是 Badea Pancreas、Segara Pancreas、Grutzmann Pancreas、Logsdon Pancreas和Pei Pancreas研究芯片。Ishikawa Pancreas、Buchholz Pancreas這2項研究芯片中兩者表達量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。分析NCBI/GEO Profiles數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)GDS4102同樣顯示COL5A2在胰腺癌組織中的表達量明顯高于正常組織（P＜0.05），見圖3h、i。

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫中COL5A2在不同類型腫瘤研究中的表達情況

圖2 Oncomine數(shù)據(jù)庫中COL5A2在胰腺癌中的表達

2.4 COL5A2在達沙替尼耐藥細胞株中的表達

NCBI/GEO Profiles數(shù)據(jù)庫中GDS5627數(shù)據(jù)顯示，與達沙替尼敏感細胞株相比，達沙替尼耐藥細胞株中COL5A2的表達明顯升高（P＜0.05）（圖4）。

2.5 COL5A2在TGF-β處理后的表達

NCBI/GEO Profiles數(shù)據(jù)庫中GDS4106數(shù)據(jù)顯示（圖5），與未經(jīng)處理的細胞相比，胰腺癌細胞株Panc-1在接受TGF-β處理48 h后，COL5A2的表達明顯升高（**P＜0.01，***P＜0.001）。

2.6 COL5A2表達與胰腺癌患者預后的關系

采用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析COL5A2表達量與胰腺癌患者預后的關系，結(jié)果顯示COL5A2高、低表達組胰腺癌患者OS無統(tǒng)計學差異（HR=1.45，95%CI：0.96～2.18，P=0.077），但高表達組胰腺癌患者的RFS明顯差于低表達組（HR=4.13，95%CI：1.46～11.72，P=0.0045）（圖 6）。

3 討論

胰腺癌早期缺乏特異性的癥狀與體征，且具有早期侵犯的生物學特征，如浸潤血管、“圍膽管”和神經(jīng)侵犯，致使大多數(shù)胰腺癌患者在確診時已屬于中晚期，預后不良，生存期短，胰腺癌的發(fā)病率幾乎等同于死亡率[17]。因此，闡明胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展機制，尋找關鍵分子或靶點，一直是備受關注和研究的熱點。

圖3 COL5A2在不同胰腺癌研究芯片中的表達情況

圖4 COL5A2在達沙替尼耐藥細胞株中的表達情況

圖5 COL5A2在TGF-β處理后的表達情況

Zhou等[8]通過整合轉(zhuǎn)錄基因組發(fā)現(xiàn)的胰腺癌關鍵基因COL5A2引起了我們的興趣。早期的多項研究發(fā)現(xiàn)一種少見的遺傳性結(jié)締組織病Ehlers-Danlos綜合征主要與COL5A2等的基因突變有關[18]，近期相關文獻報道COL5A2基因參與了多種腫瘤的病理過程。Vargas等[3]通過一系列研究觀察到，與乳腺原位導管腺癌相比，包括COL5A2在內(nèi)的與ECM重塑相關分子在浸潤性導管腺癌中的表達明顯升高，提示這些表達水平的變化可能參與促進疾病從原位向浸潤性癌癥的轉(zhuǎn)變，因此可能是疾病發(fā)生發(fā)展過程中的關鍵點。同樣，F(xiàn)ischer等[4]發(fā)現(xiàn)COL5A2在正常腸黏膜組織中無表達，但在結(jié)直腸癌組織中有表達，提示其可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。Zeng等[5]發(fā)現(xiàn)COL5A2低表達的膀胱癌患者具有良好的臨床病理分型和預后。當然，對于該基因?qū)δ[瘤預后的影響尚存在一定的分歧。Chen等[2]利用組織芯片發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，COL5A1和COL5A2在舌鱗癌組織中高表達，COL5A1高表達與臨床病理分期較晚和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關且預后較差，而COL5A2高表達患者預后良好。因此，研究者認為高（COL5A1）2/低（COL5A2）表達的舌鱗癌患者預后不良。另外，Januchowski等[7]的研究發(fā)現(xiàn)COL5A2基因可能與卵巢癌細胞的多藥耐藥有關。但是，目前國內(nèi)外尚無該基因與胰腺癌的系統(tǒng)研究。

圖6 COL5A2基因表達與胰腺癌患者預后的關系

我們發(fā)現(xiàn)Oncomine數(shù)據(jù)庫中有關COL5A2在不同胰腺癌研究芯片中表達情況的研究共7項，其中2項研究芯片中表達量差異無統(tǒng)計學意義，考慮可能與單項研究中的樣本量過小有關。進一步對上述7項研究結(jié)果進行薈萃分析發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，在所有差異表達基因中COL5A2中位數(shù)值排名為790，并在胰腺癌組織中呈高表達，與NCBI/GEO Profiles數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果一致。采用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)COL5A2高、低表達組胰腺癌患者OS無統(tǒng)計學差異，但高表達組胰腺癌患者的RFS明顯差于低表達組。正如前文所述，胰腺癌是一種病死率高、生存期短的惡性腫瘤，在整體OS較差的情況下，患者的RFS顯得尤為重要。

胰腺癌耐藥一直是臨床面臨的一大難題，因為多藥耐藥的發(fā)生，導致胰腺癌治療效果不佳，預后不良。部分研究認為ECM[19]和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）[20]參與了胰腺癌的耐藥過程。達沙替尼是Src激酶抑制劑，可用于治療包括胰腺癌在內(nèi)的多種腫瘤[21]。我們通過NCBI/GEO Profiles數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，胰腺癌細胞株Panc-1在接受TGF-β處理48 h后，COL5A2的表達明顯升高。與達沙替尼敏感細胞株相比，達沙替尼耐藥細胞株中COL5A2的表達也明顯升高。TGF-β是促進EMT發(fā)生發(fā)展的一個重要分子，TGF-β處理后的胰腺癌細胞中COL5A2表達升高提示COL5A2的表達變化可能與EMT過程密切相關，另外，COL5A2同時也是ECM的主要成分之一，結(jié)合這兩點可以部分解釋達沙替尼耐藥細胞株中COL5A2的表達升高，從而為胰腺癌的耐藥提供了新的思路。當然，這些研究僅局限于對數(shù)據(jù)庫中的資料進行的二次分析，其具體機制仍須進一步闡明。

綜上所述，COL5A2基因在胰腺癌組織中高表達，且與胰腺癌患者的無復發(fā)生存和耐藥密切相關，有望成為協(xié)助胰腺癌診斷、治療和評估預后的生物標志物。本研究主要采用數(shù)據(jù)庫進行分析，避免樣本量過小產(chǎn)生的誤差，分析結(jié)果可信度較高，但這些數(shù)據(jù)均來自芯片檢測結(jié)果，相關結(jié)論尚有待后續(xù)驗證。