于越，郁景文，許秋夢，凌新宇，奚望，張宇峰，王志農(nóng)

海軍軍醫(yī)大學(xué) 長征醫(yī)院 a.胸心外科；b.脊柱外科；上海 200003

環(huán)狀 RNA（circular RNAs，circRNAs）是一類由前體mRNA（pre-mRNA）成熟時外顯子反向剪切形成的單鏈閉合RNA。由于其不具有polyA尾，以往多聚腺苷酸RNA的分析研究中很少發(fā)現(xiàn)circRNA[1]，對其產(chǎn)生及功能也不甚了解。近年來隨著新一代測序技術(shù)的迅速發(fā)展，越來越多的circRNA進(jìn)入人們的視線。目前研究已證實超過1萬種circRNA廣泛存在于動植物細(xì)胞、細(xì)菌、病毒和真菌中[2]，部分circRNA在特定細(xì)胞或組織中高表達(dá)。circRNA的形成方式主要包括內(nèi)含子配對驅(qū)動的成環(huán)（intron pairing-driven circularization）、RNA結(jié)合蛋白配對驅(qū)動的成環(huán)（RBP pair-ing-driven circularization）以及套索驅(qū)動的成環(huán)（lariat-driven circularization）[3]。絕大多數(shù) circRNA存在于細(xì)胞質(zhì)中，部分含有內(nèi)含子的circRNA也可以定位于細(xì)胞核內(nèi)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA具有miRNA海綿（microRNA sponge）、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和合成蛋白等功能，并且在腫瘤和心血管疾病等疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。本文對circRNA的生成、調(diào)控、功能以及作為腫瘤生物標(biāo)志物的潛能做簡要綜述。

1 circRNA的生成和特性

1.1 外顯子circRNA的生成與調(diào)控

在真核細(xì)胞中，剪接體通過2次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)切除pre-mRNA中的內(nèi)含子，并將2個外顯子連接起來，形成成熟的線性RNA。部分外顯子circRNA的產(chǎn)生也依賴于此機(jī)制。Jeck等[5]提出外顯子環(huán)化的2種方式，即套索驅(qū)動環(huán)化和內(nèi)含子配對環(huán)化。套索驅(qū)動環(huán)化是pre-mRNA經(jīng)外顯子跳讀（exon skipping）和典型剪接作用后產(chǎn)生線性RNA和套索，套索下游的3'端與上游的5'端相連成環(huán)后切除內(nèi)含子形成外顯子circRNA；外顯子兩側(cè)的內(nèi)含子通過互補(bǔ)配對序列結(jié)合，在空間上縮小了剪接供體與剪接受體的距離，兩側(cè)內(nèi)含子相連接或被降解，脫落的外顯子環(huán)化形成外顯子circRNA，即內(nèi)含子配對驅(qū)動環(huán)化。此外，RNA結(jié)合蛋白通過結(jié)合兩側(cè)內(nèi)含子，也可發(fā)揮驅(qū)動環(huán)化作用。

套索驅(qū)動環(huán)化主要受外顯子跳讀調(diào)控，而內(nèi)含子配對驅(qū)動環(huán)化主要受兩側(cè)的內(nèi)含子序列尤其是反向互補(bǔ)序列調(diào)控?？鐐?cè)翼內(nèi)含子的配對與單個側(cè)翼內(nèi)含子配對間的競爭調(diào)控著circRNA的成環(huán)效率。這些互補(bǔ)序列的選擇性配對及其動態(tài)調(diào)控使得同一基因可產(chǎn)生多個circRNA，這種現(xiàn)象被稱為可變環(huán)化（alternative circularization）。RNA 結(jié)合蛋白 QKI（quaking）、MBL（muscle blind）、NF90/NF110通過作用于側(cè)翼內(nèi)含子序列，發(fā)揮促進(jìn)成環(huán)的作用[6]。RNA剪接因子作用于RNA的腺苷脫氨酶（adenosine to inosine acting on RNA enzyme 1，ADAR1），通過干擾側(cè)翼互補(bǔ)序列從而抑制成環(huán)，而剪接體對成環(huán)效率無明顯調(diào)控作用。此外，circRNA的形成還受外顯子長度、微小 RNA（microRNA，miRNA）和自身的反饋調(diào)節(jié)[7]。

1.2 內(nèi)含子circRNA的生成與調(diào)控

針對Ⅰ型和Ⅱ型內(nèi)含子，目前認(rèn)為存在不同的成環(huán)模型[8]。Ⅰ型內(nèi)含子參與常規(guī)剪接。首先，細(xì)胞核內(nèi)含鳥苷酸的輔酶以3'端羥基對5'端剪接位點發(fā)動親核進(jìn)攻，取代5'端外顯子成為內(nèi)含子的新5'端；隨后游離的外顯子3'端羥基進(jìn)攻3'端剪接位點，釋放線性內(nèi)含子，使其與下游外顯子連接。被釋放的內(nèi)含子2'端鳥苷對靠近內(nèi)含子5'端的磷酯鍵進(jìn)行親核進(jìn)攻，最終使5'端部分序列釋放并形成2'-5'連接的Ⅰ型內(nèi)含子circRNA。此種方式的特點在于內(nèi)含子不能完整保留成環(huán)。外顯子3'端剪接位點水解后，鳥苷進(jìn)攻5'端剪接位點進(jìn)而環(huán)化形成保留全長的Ⅰ型內(nèi)含子circRNA；而3'端外顯子釋放后，暴露的內(nèi)含子末端2'端羥基進(jìn)攻5'端剪接位點形成2'-5'連接的Ⅱ型內(nèi)含子circRNA[8]。內(nèi)含子環(huán)化主要受5'端剪接位點附近的一段7 nt左右富含GU堿基的序列以及一段11 nt左右富含C堿基的結(jié)構(gòu)等保守序列的調(diào)控。

1.3 circRNA的代謝

circRNA穩(wěn)定的閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)使其不具有線性RNA的3'和5'端，因此能抵抗絕大部分以3'和5'端為作用靶點的RNA酶的降解作用。circRNA主要被部分miRNA、小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）和蛋白質(zhì)降解，胞外囊泡（extra cellular vesicles，EVs）的外排作用也可以清除胞內(nèi)積蓄的circRNA[9]。小腦退行性相關(guān)蛋白基因（cerebellar degeneration-related gene 1，CDR1）反義鏈轉(zhuǎn)錄的circRNA因子CDR1as又被稱為ciRS-7（circular RNA sponge for miR-7），可被 miRNA效應(yīng)因子AGO（argonaute）蛋白家族結(jié)合并降解，也可以被miR-671降解[9]。

2 circRNA的功能

2.1 circRNA與RNA相互作用

研究發(fā)現(xiàn)，部分circRNA存在miRNA結(jié)合位點，可發(fā)揮miRNA海綿的作用，在競爭性內(nèi)源性RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中扮演重要角色[10]。例如CDR1as擁有74個miR-7結(jié)合位點，可對miR-7起負(fù)性調(diào)控作用，影響其靶基因的表達(dá)；CDR1as過表達(dá)能大量結(jié)合miR-7，導(dǎo)致其靶基因表達(dá)水平升高[11]。Y染色體性別決定區(qū)（sex-determining region Y，SRY）產(chǎn)生的circRNA擁有16個miR-138的結(jié)合位點，可結(jié)合miR-138進(jìn)而調(diào)控miR-138下游靶基因的表達(dá)水平[11]。此外，circRNA也可以與細(xì)胞外源性miRNA結(jié)合。例如circRNA可與病毒miRNA結(jié)合，從而影響免疫應(yīng)答過程[12]。Li等[13]研究發(fā)現(xiàn)，一些由外顯子環(huán)化形成的circRNA可與U1核內(nèi)小分子 RNA（small nuclear RNA，snRNA）和多種蛋白結(jié)合形成復(fù)合體，進(jìn)而與RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄復(fù)合物相互作用促進(jìn)基因表達(dá)。

2.2 circRNA與蛋白質(zhì)相互作用

2.2.1 調(diào)控基因表達(dá) circ-ankrd52和circ-sirt7可與RNA聚合酶Ⅱ相互作用調(diào)控轉(zhuǎn)錄。通過設(shè)計不同的反義核苷酸（antisenseoligode-oxynucleotide，ASO）抑制 circ-ankrd52和 circ-sirt7的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ANKRD52和SIRT7基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物減少，證明部分circRNA可以通過結(jié)合RNA聚合酶Ⅱ促進(jìn)其親本基因的轉(zhuǎn)錄[14]。

2.2.2 參與抗病毒免疫反應(yīng) 與病毒感染相關(guān)的免疫因子NF90/NF110可以與外顯子兩側(cè)配對序列結(jié)合促進(jìn)circRNA的形成，同時可與circRNA結(jié)合形成circRBP復(fù)合體。當(dāng)細(xì)胞被某些病毒感染時，NF90/NF110會與circRBP復(fù)合體解離并快速轉(zhuǎn)運至細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)而結(jié)合病毒mRNA，抑制病毒mRNA的翻譯與病毒復(fù)制。circRNA及其生成過程正是通過與NF90/NF110的協(xié)調(diào)互作，間接參與了人體抗病毒免疫[14]。

2.2.3 促進(jìn)傷口愈合 Yang等[15]利用穿刺針在同一小鼠背部兩側(cè)建立了創(chuàng)傷模型，分別注射過表達(dá) circ-Amotl1（circular angiomotin like 1）載體和對照載體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射circ-Amotl1的創(chuàng)口愈合明顯好于對照創(chuàng)口，H-E染色和免疫組化顯示注射circ-Amotl1后創(chuàng)口處組織的愈合再生活動增強(qiáng)，這與circ-Amotl1促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖活性有關(guān)。

2.2.4 參與細(xì)胞衰老進(jìn)程 缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）和局部黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）具有抑制細(xì)胞衰老的作用。研究發(fā)現(xiàn)，某些心臟病患者的心肌組織中circ-Foxo3的表達(dá)顯著升高，circ-Foxo3能與FAK和HIF-1α結(jié)合并抑制其功能，從而加速心肌細(xì)胞的衰老進(jìn)程[16]。

2.3 circRNA的翻譯功能

研究發(fā)現(xiàn)，水稻黃斑類病毒circRNA等外源性circRNA可在真核細(xì)胞內(nèi)翻譯成蛋白質(zhì)。該類circRNA擁有一個內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點和2～3個開放讀框（open reading frame，ORF），可直接翻譯為相對分子質(zhì)量16 000的基礎(chǔ)蛋白[17]。大腸桿菌和人類細(xì)胞中的circRNA可通過滾環(huán)擴(kuò)增（rolling circle amplification，RCA）機(jī)制生成多種蛋白產(chǎn)物[16]。近期研究人員構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因模型進(jìn)行蛋白組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)ZNF609基因的第2外顯子環(huán)化形成的內(nèi)源性circ-ZNF609可直接翻譯成某種與肌肉發(fā)生相關(guān)的蛋白質(zhì)，但其翻譯效率遠(yuǎn)低于線性RNA[17]。

3 circRNA與腫瘤

3.1 circRNA-miRNA軸調(diào)控腫瘤信號通道

circRNA作為一個重要的miRNA調(diào)節(jié)因子，通過發(fā)揮miRNA海綿作用進(jìn)行基因調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，ciRS-7/miR-7軸可在多種腫瘤相關(guān)路徑中發(fā)揮作用。miR-7能直接作用于靶基因mRNA并下調(diào)表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）等的表達(dá)；在乳腺癌中，miR-7/Pakl通路具有調(diào)控低侵襲性乳腺癌表型向高侵襲性乳腺癌表型轉(zhuǎn)化的作用；miR-7還可以通過下調(diào)組蛋白賴氨酸N端甲基轉(zhuǎn)移酶SET結(jié)構(gòu)域分支型 1（histone-lysine N-methyltransferase 1，SETDB1）減少轉(zhuǎn)錄信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與激活子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）的表達(dá)，從而抑制乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）進(jìn)程，發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用；在肝癌細(xì)胞中miR-7可減少磷脂酰肌醇3-激酶催化亞基δ的表達(dá)并影響肝癌細(xì)胞的遷移能力。Xu[17]發(fā)現(xiàn)miR-7可減少干擾素誘導(dǎo)蛋白P56的表達(dá)并激活轉(zhuǎn)錄因子核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB），發(fā)揮抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。此外，ciRS-7/miR-7軸可通過調(diào)節(jié)miRNA的靶基因?qū)δ[瘤發(fā)揮雙向調(diào)控作用。環(huán)狀 ITCH（cir-ITCH）發(fā)揮由 Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)的miR-7海綿作用，參與結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展；cir-ITCH還可競爭性結(jié)合miR-7、miR-17和miR-214，抑制食管癌細(xì)胞的生長。

3.2 circRNA調(diào)控腫瘤發(fā)生和發(fā)展的其他方式

ci-mcm5、ci-sirt等circRNA作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子可增強(qiáng)親本基因的轉(zhuǎn)錄過程，促進(jìn)或抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[18]。例如CZNF292通過減少膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)周期蛋白A、周期蛋白依賴性激酶2（cyclin-dependent kinases 2，CDK2）、β-catenin、p-STAT3（Tyr705）和p-STAT5（Tyr694）的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤周圍血管形成；CZNF292表達(dá)下調(diào)將導(dǎo)致 NF-κB、Sp1、HIF-1、AP-1（activator protein 1）、STAT3等相關(guān)因子對應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄水平下降，從而抑制腫瘤細(xì)胞形成[18]。circRNA還可與RBP如QKI、AGO、MBL等結(jié)合并在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[19]。RNA結(jié)合蛋白QKI-5在多種腫瘤中發(fā)揮抑制作用。腫瘤的EMT與腫瘤的侵襲性密切相關(guān)，同時circRNA表達(dá)水平上調(diào)參與對EMT的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)circRNA的生成受QKI的調(diào)控，這提供了一種由QKI介導(dǎo)的以circRNA為靶點的新的癌癥治療方法[19]。此外，circ-Foxo3可通過與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑P21及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK2形成復(fù)合體阻礙細(xì)胞周期的進(jìn)程；在腫瘤細(xì)胞中circ-Foxo3的表達(dá)量降低，細(xì)胞增殖加快。c-Myc是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，circ-Amotl1可誘導(dǎo)c-Myc進(jìn)入細(xì)胞核并增強(qiáng)其結(jié)合下游基因啟動子的能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。將PML-RARα融合基因外顯子產(chǎn)生的融合circRNA（f-circRNA）轉(zhuǎn)入白血病小鼠的細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)其具有加速細(xì)胞增殖的促癌作用；此外，circRNAf-circM9還具有增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞耐藥性的作用[20]。

3.3 circRNA與腫瘤外泌體

外泌體是一種多形性囊泡狀小體，可由各種類型的細(xì)胞分泌并廣泛分布于各種體液中。外泌體可攜帶蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、RNA等多種細(xì)胞成分；它既可被細(xì)胞釋放，也能被細(xì)胞攝取，是一種細(xì)胞間的信息傳遞系統(tǒng)。在腫瘤細(xì)胞中，外泌體通過釋放蛋白質(zhì)和mRNA等物質(zhì)促進(jìn)血管再生和細(xì)胞增殖，提高腫瘤細(xì)胞的存活率。研究發(fā)現(xiàn)，超過1000種circRNA存在于血清中的外泌體中，且含量顯著高于其對應(yīng)的線形RNA。circRNA進(jìn)入外泌體被排出細(xì)胞的過程受胞內(nèi)與之相關(guān)的miRNA水平的調(diào)節(jié)。Li等[21]研究發(fā)現(xiàn)與健康人群的血清樣本相比，結(jié)直腸癌患者的血清外泌體中有67種circRNA表達(dá)上調(diào)[20]，并且新產(chǎn)生了257種circRNA，而這些circRNA的來源基因在腫瘤組織中也顯著上調(diào)，提示血清中circRNA的含量與腫瘤組織中某些基因的表達(dá)變化有關(guān)，而外泌體中的circRNA是否參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展須進(jìn)一步研究證實。血清外泌體中的circRNA在腫瘤患者與健康人群中呈差異性表達(dá)，表明其具有成為一種新型腫瘤診斷標(biāo)志物的潛力[21]。

4 circRNA作為腫瘤生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展

越來越多的研究表明circRNA在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中扮演重要角色，同時，circRNA具有含量豐富、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、時空特異性和組織細(xì)胞特異性等特征，且可在唾液、血液、外泌體中被檢出。因具備上述特征，circRNA作為腫瘤生物標(biāo)志物已逐漸成為研究熱點（表1）。

4.1 篩查或診斷腫瘤

表1 circRNA作為腫瘤生物標(biāo)志物

Nair等[26]發(fā)現(xiàn)了乳腺癌腫瘤組織中1155種特異性表達(dá)的circRNA，與周圍正常組織相比有715種表達(dá)上調(diào)。在疾病的相關(guān)性分析中，聯(lián)合circ-006054、circ-406697和circ-100219進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線的曲線下面積（area under curve，AUC）達(dá)到0.82，提示聯(lián)合應(yīng)用這3種circRNA可以作為較好的乳腺癌生物標(biāo)志物[26]。在胃癌患者的腫瘤組織和血漿中，circ-000190表達(dá)顯著下調(diào)；與傳統(tǒng)的胃癌生物標(biāo)志物癌胚抗原（CEA）和CA19-9相比，circ-000190具有更高的敏感度和特異度，提示circ-000190具有作為診斷胃癌生物標(biāo)志物的潛能。此外，hsa_circ_0002059可能與胃癌的發(fā)生相關(guān)，胃癌患者外周血血清中可檢測出hsa_circ_0002059，且其表達(dá)量高于健康人群，提示外周血中hsa_circ_0002059的表達(dá)具有作為胃癌生物標(biāo)志物的潛能。研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0001649的表達(dá)在肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）組織中顯著下調(diào)。與癌旁組織相比，肝癌組織中hsa_circ_0005075的表達(dá)存在差異，且hsa_circ_0001649的表達(dá)量與肝癌組織大小相關(guān)。

4.2 判斷腫瘤轉(zhuǎn)移與預(yù)后

研究發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung carcinoma，NSCLC）組織中表達(dá)水平上調(diào)的circRNA_100876與肺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分期密切相關(guān)，提示circRNA_100876可作為判斷NSCLC轉(zhuǎn)移和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物[25]；circTCF25是一種與胃癌細(xì)胞增殖相關(guān)的circRNA[24]。一項包含187例臨床樣本的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，circPVT1高表達(dá)患者的生存率更高。提示circPVT1可能是一項獨立于腫瘤大小、TNM分期的可用于判斷胃癌患者預(yù)后的臨床指標(biāo)。

4.3 預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)

胃癌復(fù)發(fā)常出現(xiàn)在Ⅲ期患者接受根治性切除術(shù)后1年內(nèi)。Zhang等利用circRNA芯片發(fā)現(xiàn)了46種在腫瘤組織中特異性表達(dá)的circRNA，最終建立了以4種circRNA為基礎(chǔ)的臨床標(biāo)本術(shù)后復(fù)發(fā)預(yù)測體系，該方法的AUC值達(dá)0.764，高于對照組的0.711，表明聯(lián)合檢測這4種circRNA的表達(dá)可成為監(jiān)測Ⅲ期胃癌根治性切除術(shù)后復(fù)發(fā)的生物標(biāo)志物。

4.4 circRNA和其他腫瘤生物標(biāo)志物

腫瘤外泌體的分子特征可部分反映其來源腫瘤的表型，它所攜帶的腫瘤特異性抗原和miRNA可以作為腫瘤診斷標(biāo)志物。在包括膀胱癌、結(jié)直腸癌和黑色素瘤等在內(nèi)的多種腫瘤臨床病例中，均可以從患者血清、尿液等體液中分離得腫瘤外泌體用于早期診斷。circRNA作為一種新型的潛在生物標(biāo)志物，與傳統(tǒng)腫瘤生物標(biāo)志物關(guān)系密切。研究表明，HCC患者ciRS-7的表達(dá)水平與甲胎蛋白（AFP）和微血管侵犯（MVI）有關(guān)。此外，hsa_circ_0005075分別與傳統(tǒng)HCC生物標(biāo)志物miR-93和miR-182有潛在的結(jié)合位點。因此，將circRNA與傳統(tǒng)腫瘤生物標(biāo)志物聯(lián)合運用，可能是相關(guān)疾病診斷的更有效的方法與途徑。

5 結(jié)語

目前關(guān)于circRNA的種類、來源、生物學(xué)特征以及功能等已有一定認(rèn)識，但與其他RNA相比，對于circRNA的研究仍處于起步階段。circRNA的表達(dá)調(diào)控、對miRNA的海綿作用、對基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、病毒調(diào)控作用、蛋白質(zhì)的翻譯，以及其與疾病的關(guān)聯(lián)等均須更深入的探討。已有腫瘤疾病相關(guān)研究將血液中的circRNA與現(xiàn)有臨床生物標(biāo)記物進(jìn)行比較，試圖發(fā)掘circRNA單獨或聯(lián)合應(yīng)用于臨床診斷的前景，并且在某些腫瘤中已經(jīng)初步證實了其潛在的應(yīng)用價值。circRNA的特異性和穩(wěn)定性或許會成為其作為生物標(biāo)記物的關(guān)鍵優(yōu)勢。雖然尚不能斷言circRNA一定可用于疾病的診斷、療效判斷及預(yù)后等，但隨著circRNA研究手段和方法的不斷進(jìn)步和完善，有理由相信未來circRNA的價值會被更多地挖掘，circRNA在臨床方面的研究必將呈現(xiàn)突破性進(jìn)展。