李祖任 柏連陽(yáng)

摘要：隨著多組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)在雜草領(lǐng)域中的應(yīng)用已是國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。簡(jiǎn)述蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的基本概念;概述蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)研究現(xiàn)狀;介紹多組學(xué)聯(lián)合分析的研究策略;論述蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)在雜草學(xué)領(lǐng)域的研究?jī)r(jià)值及研究現(xiàn)狀;并探討了目前研究中存在的問(wèn)題及今后研究的主要方向。旨在為今后蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)在雜草領(lǐng)域的研究提供參考。

關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)組學(xué);代謝組學(xué);多組學(xué)聯(lián)合分析;雜草科學(xué)

中圖分類號(hào)：S451 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ?文章編號(hào)：1003-935X（2020）01-0001-06

Abstract：With the development of multi-omics technology，application of proteomics and metabonomics in weed science has become an attractive research topic at home and abroad. Proteomics and metabonomics are reviewed，including their basic conception，technological development，and multi-omics analysis. The value and status of proteomics and metabonomics in weed science are expounded，and the current problems and future direction are explored.

Key words：proteomics;metabonomics;multi-omics analysis;weed science

1 蛋白質(zhì)組和代謝組學(xué)簡(jiǎn)述

蛋白質(zhì)組（proteome）是在不同時(shí)空條件下由生物體基因組、細(xì)胞或組織表達(dá)的所有蛋白質(zhì)[1]。蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）是在各種不同環(huán)境條件下生物體基因組、細(xì)胞或組織表達(dá)全部蛋白質(zhì)互作機(jī)制及其功能的學(xué)科[2]?；蚪M是穩(wěn)定的，并在同一生物體的所有體細(xì)胞中是相同的。與基因組不同，蛋白質(zhì)組則是多樣性的，也就是說(shuō)作為一個(gè)有機(jī)整體，在特定條件下同一生物體的蛋白質(zhì)組與基因組不一定一一對(duì)應(yīng)[3]。因此，只有對(duì)生物體內(nèi)所有蛋白質(zhì)，即蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行研究，才能更加精準(zhǔn)、完整地發(fā)現(xiàn)生物與環(huán)境互作等生命活動(dòng)的深層次機(jī)制，并利用其內(nèi)在規(guī)律。目前大多數(shù)學(xué)者將蛋白質(zhì)組研究?jī)?nèi)容歸結(jié)為以下3個(gè)方面：（1）大量鑒定生物體內(nèi)蛋白質(zhì)特性及翻譯后修飾的變化;（2）通過(guò)比較蛋白組學(xué)技術(shù)研究在蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)差異，這對(duì)于大多數(shù)科學(xué)研究具有巨大潛力;（3）研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的互作機(jī)制，建立功能連鎖圖[4]。

代謝組（metabolome）是在各種生理?xiàng)l件下生物體或細(xì)胞所產(chǎn)生的全部代謝物（metabolite）[5]。曾經(jīng)科學(xué)界對(duì)代謝組學(xué)定義存在2種不同觀點(diǎn)：一種是在20世紀(jì)90年代英國(guó)帝國(guó)理工學(xué)院的Nicholson等將“定量測(cè)定各種生理刺激或遺傳改造所導(dǎo)致生命體的多指標(biāo)代謝動(dòng)態(tài)響應(yīng)”定義為代謝組學(xué)（metabonomics）;另一種是2l世紀(jì)初美國(guó)加州大學(xué)戴維斯分校的Fiehn提出“生物體系中全部代謝物進(jìn)行全面、定量的分析”是代謝組學(xué)（metabolomics）[6]。目前代謝組學(xué)（metabolomics或metabonomics）通常被定義為在某一生理期內(nèi)定性和定量分析生物或細(xì)胞全部低分子量（<1 ku）代謝產(chǎn)物，以便從整體上反映植物代謝物的變化及其調(diào)控，為解析植物生長(zhǎng)發(fā)育及其與環(huán)境因子的互作奠定基礎(chǔ)[7]。

2 蛋白質(zhì)組和代謝組學(xué)的研究技術(shù)簡(jiǎn)介

2.1 蛋白質(zhì)組研究技術(shù)

蛋白質(zhì)組學(xué)研究需要一套完整的技術(shù)體系，其中蛋白質(zhì)分離技術(shù)和鑒定技術(shù)是最為關(guān)鍵的技術(shù)之一。

蛋白質(zhì)分離技術(shù)主要是電泳，其中應(yīng)用最廣泛的是雙向凝膠電泳（two-dimensional gel electrophoresis，簡(jiǎn)稱2DE）和高效液相色譜。20世紀(jì)70年代中葉報(bào)道的雙向凝膠電泳是最經(jīng)典和最成熟的蛋白質(zhì)組分離技術(shù)[8]。雙向電泳采用2次凝膠電泳，利用不同蛋白質(zhì)的帶電性和分子量大小的物理化學(xué)性質(zhì)差異的特性從而達(dá)到分離各種不同蛋白質(zhì)的目的[9]。雙向電泳技術(shù)的流程為蛋白質(zhì)樣品制備——干膠條水合——等電聚焦——聚焦后膠條平衡——十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳——凝膠染色——圖像掃描[10]。樣品制備是雙向電泳的第一步，是關(guān)系到雙向電泳成敗的首要因素。大多數(shù)樣品制備時(shí)，應(yīng)避免細(xì)胞死亡而導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解，并盡快將材料儲(chǔ)存于液氮中。將樣品在液氮中徹底研磨成細(xì)粉，并迅速加入熱蛋白沉淀劑，充分搖勻后，將其沉淀并在低溫下離心[11]。2DE具有成本低、重復(fù)性高的優(yōu)點(diǎn)，但是缺點(diǎn)也明顯，即只能分析可溶性蛋白，工作量大，需要較大量的蛋白樣品等，可能是因?yàn)榧?xì)胞或組織中蛋白質(zhì)含量分布不均，也許會(huì)造成一個(gè)染色點(diǎn)上含有多種蛋白的狀況[12]。高效液相色譜是根據(jù)固液相之間的分子尺寸、等電點(diǎn)、親水性、電荷等特性不同，以高壓輸液泵為動(dòng)力裝置，將流動(dòng)相和樣品的混合液帶入填充固定相的色譜柱，從而達(dá)到一種從混合物樣品溶液中分離蛋白質(zhì)的技術(shù)[13]。首先根據(jù)蛋白質(zhì)大小通過(guò)排阻色譜（正相柱）分離蛋白質(zhì)，并將該餾分自動(dòng)引入反相液相色譜（反相柱）中以獲得二維色譜圖;其次將分析物轉(zhuǎn)移至96孔板上并自動(dòng)加至基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）靶標(biāo)以進(jìn)行鑒定，這樣2個(gè)色譜柱串聯(lián)起來(lái)組成二維液相色譜系統(tǒng)[14]。高效液相色譜（HPLC）雖然成本高，但是其靈敏度高，分析速度快，自動(dòng)化程度高，可分離分子尺寸差異大、低豐度、疏水性蛋白質(zhì)[15]。

傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)如Edman降解法和氨基酸分析已被生物質(zhì)譜分析技術(shù)所取代。生物質(zhì)譜法首先是通過(guò)電離樣品分子并根據(jù)不同離子間的質(zhì)荷比（m/z）差異分離和確定樣品的分子量，其次是依據(jù)蛋白質(zhì)酶解后的肽質(zhì)量指紋圖譜和肽序列信息，搜索蛋白質(zhì)或核酸序列文庫(kù)，該技術(shù)具有靈敏度高、分辨率高的優(yōu)點(diǎn)，是迄今為止蛋白質(zhì)定性的最佳工具[16]。質(zhì)譜技術(shù)要求使用提純的樣品，曾經(jīng)一度被認(rèn)為不適合蛋白質(zhì)間比較，尤其是蛋白質(zhì)定量比較，在引入穩(wěn)定同位素標(biāo)記分子后得到了有效彌補(bǔ)。質(zhì)譜技術(shù)主要使用肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF）和肽片段指紋圖譜（PFF）。PMF通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）測(cè)量，其使用激光照射來(lái)電離肽段，然后通過(guò)測(cè)定離子在電場(chǎng)力作用下的飛行時(shí)間（time of flying，簡(jiǎn)稱TOF），來(lái)計(jì)算其質(zhì)量電荷比，獲得肽段的分子量或序列等信息，最后搜索數(shù)據(jù)庫(kù)以鑒定蛋白質(zhì)[17]。MALDI-TOF-MS法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，與其他蛋白分離方法兼容，并且蛋白質(zhì)的質(zhì)荷比數(shù)據(jù)充足，已成為蛋白質(zhì)鑒定的首選。PFF通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜（Tandem MS，簡(jiǎn)稱MS/MS）法測(cè)量，其使用電噴霧質(zhì)譜法檢測(cè)由液相分離出的肽段，并打斷肽段母離子形成碎片離子，通過(guò)質(zhì)量分析器測(cè)量碎片離子的分子量，即得MS/MS質(zhì)譜圖，在分析圖譜中不同碎片的質(zhì)量差時(shí)，預(yù)測(cè)被測(cè)肽段的序列，然后在序列信息庫(kù)中比對(duì)和鑒定蛋白質(zhì)[18]。該技術(shù)具有精度高、分析時(shí)間短，可同時(shí)處理多個(gè)樣品的優(yōu)勢(shì)[19]。

2.2 代謝組研究技術(shù)

整個(gè)植物界中有超過(guò)200 000種代謝物，至今仍沒(méi)有一種代謝組學(xué)技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)有機(jī)體中全部代謝產(chǎn)物的定量分析;植物體內(nèi)的代謝物種類繁多，代謝物定性分析不僅難以完成，而且準(zhǔn)確度難以保證[20]。質(zhì)譜（mass spectrometry，簡(jiǎn)稱MS）、核磁共振（nuclear magnetic resonance，簡(jiǎn)稱NMR）、紅外光譜、庫(kù)倫分析、紫外吸收及熒光散射均可用于植物代謝物的檢測(cè)，其中研究與應(yīng)用最廣的技術(shù)是質(zhì)譜和核磁共振[21]。

20世紀(jì)70年代早期，核磁共振技術(shù)被應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)代謝組學(xué)研究。核磁共振是一種原子核在吸收射頻輻射后產(chǎn)生能級(jí)變遷的譜學(xué)技術(shù)，原理是原子核在核外磁場(chǎng)力的驅(qū)動(dòng)下自旋程度不同[20，22]。NMR用于代謝組研究中，主要使用H譜、C譜和P譜，可高通量測(cè)定樣品中絕大多數(shù)的代謝物，能適應(yīng)現(xiàn)代研究對(duì)代謝組學(xué)的技術(shù)要求，即通過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)定性和定量測(cè)定盡可能多的化合物[23]。H-NMR的譜峰不僅可體現(xiàn)樣品中各代謝物的氫原子，而且能利用圖譜中信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)弱表明其相對(duì)含量[20]。因此，NMR方法適用于樣品代謝物的定性和定量分析，獲得的一維H光譜即是代謝指紋，在模式識(shí)別后得出相應(yīng)且有價(jià)值的生物信息，并將其進(jìn)行生物信息學(xué)統(tǒng)計(jì)分析，從而獲得生物體在生命活動(dòng)中的代謝途徑信息[24]。NMR是現(xiàn)有代謝組學(xué)中唯一能用于活體和原位的分析技術(shù)，優(yōu)勢(shì)是對(duì)樣品無(wú)輻射損傷;定量更簡(jiǎn)單、無(wú)需預(yù)選擇試驗(yàn)條件，只需簡(jiǎn)單的預(yù)處理，便可在接近生理?xiàng)l件下獲得具有較高信息量的圖譜[25]。NMR主要的缺陷是購(gòu)置成本較高，靈敏度較低，對(duì)樣品的要求較高[26]。當(dāng)前為了提高分辨率，植物代謝組的研究一般采用多維核磁共振技術(shù)、液相色譜核磁共振聯(lián)用和結(jié)合13C或15N的穩(wěn)定同位素標(biāo)記聯(lián)用技術(shù)[27-28]。Griffin等利用靈敏度高的魔角旋轉(zhuǎn)（magic angle spinning，簡(jiǎn)稱MAS）技術(shù)，獲得了高分辨率、高水平的NMR譜圖[29]。

目前應(yīng)用最廣泛、最有效的代謝組學(xué)檢測(cè)技術(shù)是氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，簡(jiǎn)稱GC-MS）和液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometr，簡(jiǎn)稱 LC-MS），可檢測(cè)生物體內(nèi)糖、糖醇、氨基酸、有機(jī)酸、脂肪酸和芳胺，以及大量次級(jí)代謝物等數(shù)百種化學(xué)性質(zhì)不同的化合物[30]。GC-MS適宜分析小分子、熱穩(wěn)定、易揮發(fā)、能氣化的化合物，具有較高的分辨率和靈敏度，后期數(shù)據(jù)分析可借助現(xiàn)成的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)[31]。利用二級(jí)氣相色譜與飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（GC- GC-TOF-MS）可進(jìn)行高能量分析，其檢測(cè)的代謝物范圍更廣[32]。但是，GC分離代謝物分子量范圍較窄，不能分離大分子物質(zhì)，而且無(wú)法分離熱不穩(wěn)定性和不能氣化的代謝產(chǎn)物[33]。LC-MS則可分析高極性、相對(duì)分子質(zhì)量大及熱穩(wěn)定性差的化合物[34]。大多數(shù)情況下 LC-MS 無(wú)需衍生化處理，僅需簡(jiǎn)便的預(yù)處理就可上機(jī)檢測(cè)，特別是分離效率高、速度快和應(yīng)用較廣的高效液相色譜[35]。反相液相色譜（reverse phase liquid chromatography，簡(jiǎn)稱RPLC）一般用來(lái)分析非極性和中等極性化合物，親和相互作用色譜（hydrophilic interaction chromatography，簡(jiǎn)稱HILIC）與固相萃取聯(lián)用一般用于分析強(qiáng)極性化合物[36]。采用極性硅膠或衍生膠作為HILIC的固定相，而其流動(dòng)相則采用極性有機(jī)溶劑或水溶液，其尤其適于強(qiáng)極性和強(qiáng)親水性小分子物質(zhì)的分離[37]。

3 多組學(xué)聯(lián)合分析

隨著質(zhì)譜、核磁共振等技術(shù)的日新月異，獲取蛋白質(zhì)組、代謝組等單一高通量組學(xué)數(shù)據(jù)變得更容易、更精確。雖然單一組學(xué)分析可以描述在該領(lǐng)域中某一生物學(xué)過(guò)程或者功能，但是生命活動(dòng)本質(zhì)包含了多層次、多水平和多功能的復(fù)雜結(jié)構(gòu)體系，這就需要將多層組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合分析。多層組學(xué)聯(lián)合分析是指歸一化和比較分析不同組學(xué)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，構(gòu)建不同組間數(shù)據(jù)的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，基于多組學(xué)數(shù)據(jù)從基因、轉(zhuǎn)錄、蛋白和代謝水平分層次多角度深入解析對(duì)應(yīng)的生物過(guò)程，從而更準(zhǔn)確、更全面、更系統(tǒng)地理解生物體響應(yīng)外界的生理過(guò)程[38]。

對(duì)來(lái)自蛋白質(zhì)和代謝組等多層次的組學(xué)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析的一般技術(shù)流程為根據(jù)中心法則，先分別計(jì)算各種組學(xué)結(jié)果中的差異表達(dá)情況，再利用系統(tǒng)生物學(xué)手段推算差異表達(dá)分子的生物學(xué)功能，進(jìn)一步采用網(wǎng)絡(luò)協(xié)同調(diào)控的邏輯整合分析轉(zhuǎn)錄，蛋白和代謝等組學(xué)差異分子生物學(xué)功能，即無(wú)論是哪個(gè)組學(xué)的差異數(shù)據(jù)，篩選依據(jù)是根據(jù)功能而定，它們共同處于同一網(wǎng)絡(luò)中或上下游關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)中[39]。通過(guò)不同組學(xué)結(jié)果的聯(lián)合分析，多組間驗(yàn)證互補(bǔ)，以全方位認(rèn)識(shí)生物體應(yīng)對(duì)的變化大趨勢(shì)，并進(jìn)一步提出生物體的分子應(yīng)答模型，并篩選出顯著相關(guān)的代謝通路或者蛋白、基因、代謝物，為后續(xù)功能驗(yàn)證提供基礎(chǔ)[40]。

4 蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)在雜草科學(xué)中的應(yīng)用

近年來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，尤其是同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（iTRAQ）技術(shù)，已應(yīng)用于雜草領(lǐng)域相關(guān)研究[41]。Yang等采用iTRAQ技術(shù)，分析研究了多抗性稗草和敏感性稗草葉片的蛋白質(zhì)組學(xué)以及蛋白表達(dá)差異，從蛋白水平揭示了除草劑抗性引起生態(tài)適合度代價(jià)的機(jī)制[42]。隨著種子儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，紫莖澤蘭種子的14個(gè)蛋白質(zhì)發(fā)生了顯著變化，探析了紫莖澤蘭種子衰老的分子機(jī)理[43]。王振英等用蛋白質(zhì)學(xué)技術(shù)分析了經(jīng)光系統(tǒng)II抑制除草劑莠去津（Atrazine）處理小麥幼苗的葉綠體蛋白質(zhì)組變化，找到了6個(gè)在3個(gè)代謝途徑中起重要作用的蛋白[44]。Sun等利用iTRAQ技術(shù)分析出了咪唑乙煙酸對(duì)pgr5擬南芥突變體的光合作用、糖酵解和三羧酸循環(huán)（TCA）的破壞程度比較大[45]。Fidel等利用蛋白質(zhì)組技術(shù)比對(duì)分析了小飛蓬抗草甘膦和敏感2種生物型蛋白差異，揭示了葉綠體是抗草甘膦小飛蓬的第一個(gè)靶標(biāo)[46]。Li等采用Label-free蛋白質(zhì)學(xué)技術(shù)分析了植物源羊脂酸處理小飛蓬葉片的蛋白差異，表明光合蛋白顯著響應(yīng)了植物源羊脂酸的處理[47]。

目前，代謝組學(xué)技術(shù)已開(kāi)始逐漸應(yīng)用于雜草科學(xué)，尤其是基于色譜或核磁共振的代謝組學(xué)技術(shù)。Aranibar等首次將代謝組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于除草劑作用靶標(biāo)的自動(dòng)化檢測(cè)，并構(gòu)造了以作用靶標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)的除草劑分類的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型[48]。Trenkamp等選用4種作用靶標(biāo)不同除草劑的草銨膦、磺草酮、AE944甲酰胺磺隆呋草磺和草甘膦處理擬南芥，分析GC-TOF/MS得到的與時(shí)間相關(guān)的代謝物輪廓（譜），可區(qū)分代表谷氨酰胺合成酶、4-羥基苯丙酮酸雙加氧酶（4-HPPD）、纖維素生物合成（不明靶標(biāo)）、乙酰乳酸合成酶（ALS）、5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）等除草劑作用靶標(biāo)[49]。Aliferis等開(kāi)發(fā)出一種與多邊分析聯(lián)用的H-NMR代謝指紋圖譜分析法，并用于鑒別天然植物毒素pyrenophorol的作用靶標(biāo)[50]。徐華東應(yīng)用NRM代謝組學(xué)方法研究了丁草胺的毒性機(jī)制，并聯(lián)合分析組織病理學(xué)檢查和生化指標(biāo)，系統(tǒng)地探究了在內(nèi)源性小分子代謝物水平上丁草胺對(duì)金魚(yú)（Carassiusauratus）的4個(gè)重要器官（鰓、腦、肝、腎）的毒理機(jī)制[51]。Miyagi等采用靶標(biāo)代謝組技術(shù)研究了鈍葉酸模（Rumexobtusifolius L.）在不同光照和溫度條件下不同器官代謝物的積累情況，發(fā)現(xiàn)檸檬酸-異檸檬酸-草酸分流是響應(yīng)光與黑暗的途徑[52]。

5 展望

隨著功能基因研究的深入，蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)已成為系統(tǒng)生物學(xué)研究領(lǐng)域至關(guān)重要的技術(shù)手段。生物體的遺傳信息由基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄向蛋白質(zhì)傳遞，基因功能又由表達(dá)產(chǎn)物體現(xiàn)，功能基因組學(xué)應(yīng)用于細(xì)胞不同層面上的研究探索，各部分內(nèi)容緊密相連，環(huán)環(huán)相扣。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)研究在雜草領(lǐng)域有一定的應(yīng)用，但主要利用組學(xué)技術(shù)探究差異蛋白或者代謝物，缺乏對(duì)差異蛋白或代謝物所在代謝通路的研究，即缺乏功能基因組上的深層次探究。

利用蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)在不同水平和尺度上多層次系統(tǒng)分析雜草的生理功能和作用模式，從全局精確掌握各類雜草在各種逆境下的代謝網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控機(jī)制，為后續(xù)的農(nóng)田高效除草，創(chuàng)制新型靶標(biāo)除草劑等研究提供基礎(chǔ)。今后蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)在雜草科學(xué)研究的可能研究方向如下：（1）雜草響應(yīng)各種逆境的內(nèi)在分子機(jī)制;（2）化感物質(zhì)抑草靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)，并以此設(shè)計(jì)合成新型除草劑;（3）雜草抗藥性靶標(biāo)突變與代謝抗性機(jī)制。

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