鄭利 覃川杰

摘要 寬體金線蛭是一味中藥材，具有活血化瘀、抗血栓、抗腫瘤及抗早孕等重要作用，其唾液腺中存在著能減緩血液凝固、抑制血栓形成的水蛭素。目前，寬體金線蛭體內(nèi)的活性成分是治療心血管疾病重要藥物之一，因此寬體金線蛭在藥業(yè)市場(chǎng)的需求量大。近十幾年來(lái)，寬體金線蛭養(yǎng)殖技術(shù)和水蛭素藥用價(jià)值深受研究者關(guān)注。主要?dú)w納和總結(jié)了寬體金線蛭的生物學(xué)特性、養(yǎng)殖技術(shù)，水蛭素的提取方法、藥理作用等方面的研究進(jìn)展，以期為寬體金線蛭的養(yǎng)殖和開(kāi)發(fā)提供參考。

關(guān)鍵詞 寬體金線蛭;生物學(xué)特性;養(yǎng)殖技術(shù);分離純化;活性測(cè)定;藥理作用

中圖分類號(hào) S917.4? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2020）20-0001-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.20.001

Research Progress of Whitmania pigra

ZHENG Li 1，2，QIN Chuanjie 1，2 （1.College of Life Science， Neijiang Normal University， Neijiang，Sichuan 641100; 2. Key Laboratory of Sichuan Province for Fishes Conservation and Utilization in the Upper Reaches of the Yangtze River， Neijiang Normal University， Neijiang，Sichuan 641100）

Abstract Whitmania pigra is a kind of traditional Chinese medicine. It has the functions of promoting blood circulation，removing blood stasis， antithrombotic， antitumor and anti early pregnancy. Hirudin ，in salivary gland of W. pigra，relieve blood coagulation and inhibit thrombosis.At present， hirudin of W. pigra is an important drug for the treatment of cardiovascular diseases. So W. pigra has a large demand in the pharmaceutical market.In recent ten years， the cultivation technology of W.pigra and the medicinal value of hirudin have attracted much attention of researchers. In this paper， the biological characteristics， cultivation technique， the extraction method and pharmacological action of hirudin were summarized， in order to provide reference for the farming and development of W. pigra.

Key words Whitmania pigra;Biological characteristics;Cultivation technique;Separation and purification;Activity determination; Pharmacological action

寬體金線蛭（Whitmania pigra ）隸屬于環(huán)節(jié)動(dòng)物門、蛭綱、無(wú)吻蛭目、黃蛭科、金線蛭屬 [1]，其分布范圍廣 [2]、個(gè)體大、適應(yīng)能力強(qiáng)，可用于治療血滯經(jīng)閉、瘀血和跌打損傷等癥狀 [3]。隨著生物技術(shù)的蓬勃發(fā)展，寬體金線蛭的藥用價(jià)值陸續(xù)被挖掘利用。從寬體金線蛭頭部和口部提取的水蛭素，不僅有活血化瘀的作用，還具有抗癌、抗細(xì)胞凋亡和抗早孕等作用，且為目前治療心腦血管疾病的重要藥物之一。隨著社會(huì)老齡化問(wèn)題不斷加重，心腦血管疾病患者不斷增加，對(duì)水蛭素等抗凝藥物的需求量越來(lái)越大。然而化肥和農(nóng)藥的大量使用，使自然環(huán)境逐年惡化，加上人工過(guò)度捕撈，野生寬體金線蛭資源嚴(yán)重不足，這使寬體金線蛭不能滿足市場(chǎng)需求。為此，對(duì)其進(jìn)行大規(guī)模引種養(yǎng)殖是解決這一問(wèn)題的有效途徑。此外，水蛭素的純化程度和活性強(qiáng)弱是影響藥物效果的重要因素。欲獲得高純度、抗凝血作用強(qiáng)的水蛭素，則需要采用恰當(dāng)?shù)姆蛛x純化和活性測(cè)定法，才能有效提高水蛭素的提取率、純度和抗凝作用。筆者主要從寬體金線蛭的生物學(xué)特性、養(yǎng)殖技術(shù)，水蛭素的分離純化、活性檢測(cè)以及藥理作用方面進(jìn)行綜述，以期為寬體金線蛭的養(yǎng)殖和開(kāi)發(fā)提供參考資料。

1 寬體金線蛭的生物學(xué)特性

1.1 形態(tài)學(xué)特征 寬體金線蛭個(gè)體較大，其體型為紡錘且扁平型，體長(zhǎng)7～13 cm，寬1.3～2.0 cm，體重10～30 g;蛭體有2個(gè)吸盤分別位于其前后的尖端處;寬體金線蛭的前吸盤與后

吸盤不斷交替吸附物體可使蛭體運(yùn)動(dòng)，其主要的運(yùn)動(dòng)方式有游泳式、尺蠖式和蠕動(dòng)式 [4]。寬體金線蛭的口腔內(nèi)生長(zhǎng)著比較發(fā)達(dá)的顎，顎表面有2列用來(lái)撕破宿主皮膚的齒板 [5]。寬體金線蛭體表的顏色會(huì)因環(huán)境不同而稍有區(qū)別，大多數(shù)蛭體背部由暗綠和黃黑相間的縱線條紋組成，且位于中間的條紋顏色較深;蛭體腹面呈淡黃色且混雜著許多不規(guī)則的暗綠色斑點(diǎn);處于生殖季節(jié)的寬體金線蛭體表有較明顯的生殖環(huán)帶，但非生殖季節(jié)的蛭體表面環(huán)帶不是很明顯 [6]。

1.2 生活習(xí)性 自然環(huán)境里的寬體金線蛭一般喜歡生活在較溫暖的沿岸淺水區(qū)，環(huán)境安靜隱蔽、水流緩慢、有較多的水生植物和水生軟體動(dòng)物，便于寬體金線蛭吸附物體活動(dòng)和攝取食物，沿岸處要有濕潤(rùn)疏松和腐殖質(zhì)豐富的土壤，便于寬體金線蛭產(chǎn)卵孵化 [7]。在人工養(yǎng)殖過(guò)程中，用于寬體金線蛭產(chǎn)卵孵化的土壤需要保持一定的濕度，其土壤基質(zhì)的濕度一般以60%為宜 [8-9]，便于寬體金線蛭的種蛭鉆入土壤層中產(chǎn)卵繭。吳雷明等 [10]研究發(fā)現(xiàn)蘑菇菌渣與土壤混合組比單獨(dú)的蘑菇菌渣組和土壤組幼蛭孵化率高。童水明等 [11-12]研究認(rèn)為寬體金線蛭偏好于稻草基質(zhì)上產(chǎn)卵，膨脹蛭石可作為其蛭卵的孵化保溫基質(zhì)利于孵化。郭坤等 [13]研究認(rèn)為將稻草和土壤按1∶1混合后適合作為寬體金線蛭的越冬基質(zhì)。

寬體金線蛭是一種變溫動(dòng)物。溫度的變化對(duì)寬體金線蛭影響較大 [4]。自然水溫在10 ℃以下時(shí)會(huì)使寬體金線蛭陸續(xù)進(jìn)入冬眠狀態(tài);13 ℃的水溫會(huì)使寬體金線蛭陸續(xù)出土攝食 [14];25 ℃是寬體金線蛭幼蛭生長(zhǎng)速率最快、存活率最佳的養(yǎng)殖水溫 [15]。水溫在30 ℃以上時(shí)寬體金線蛭會(huì)出現(xiàn)急躁、瘋狂游動(dòng)，水溫超過(guò)35 ℃或低于4 ℃時(shí)出現(xiàn)大量死亡 [16]。寬體金線蛭主要生活于淡水中，其對(duì)水體中的含鹽量要求不高，一般不應(yīng)超過(guò)0.1% [4]。寬體金線蛭適合生活在pH為 6.5～8.0的水體中 [16]。寬體金線蛭主要依靠體表進(jìn)行有氧呼吸，它對(duì)水體溶解氧的量要求不高，在適宜溫度條件下，寬體金線蛭能在水體溶解氧為1 mg/L以上生長(zhǎng)良好 [7]。

自然水域中的螺螄類、蛙類和蜆等軟體動(dòng)物是寬體金線蛭的天然餌料 [8-9]。在人工養(yǎng)殖條件下，動(dòng)物的內(nèi)臟、配合飼料和雜魚(yú)類等可作為寬體金線蛭的餌料 [17]。寬體金線蛭幼蛭生長(zhǎng)過(guò)程中，使用高質(zhì)量的餌料對(duì)其健康生長(zhǎng)極為重要。蔡銀碧等 [18]研究發(fā)現(xiàn)與鴨血和菲牛蛭配合飼料相比，螺類更適合作為寬體金線蛭餌料。吳雷明等 [19]研究認(rèn)為與蚯蚓相比，漂螺適合作為幼蛭的餌料，但應(yīng)該用蚯蚓搭配使用，以提高幼蛭免疫力。王建國(guó)等 [20]研究認(rèn)為幼蛭對(duì)螺螄餌料的個(gè)體大小具有選擇性，一般投喂體積小的螺螄且早期投喂量為幼蛭體質(zhì)量的11倍以上，才能滿足幼蛭生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)需要。童水明等 [21]研究發(fā)現(xiàn)更適合作為寬體金線蛭幼蛭生長(zhǎng)的餌料是福壽螺，而非田螺。王亞等 [22]研究認(rèn)為與田螺相比，以椎實(shí)螺作為寬體金線蛭苗餌料能顯著促進(jìn)其生長(zhǎng)，提高幼苗存活率。林小清等 [23]研究發(fā)現(xiàn)最佳寬體金線蛭仔蛭生長(zhǎng)的餌料是由原生動(dòng)物與螺螄混合所制。王宣朋等 [24]研究發(fā)現(xiàn)以輪蟲(chóng)和圓田螺作為餌料的仔蛭生長(zhǎng)率最快、存活率最佳，這與馬春慶等 [15]的研究結(jié)果基本一致。由此可見(jiàn)，投喂原生動(dòng)物與田螺混合而成的餌料，有利于寬體金線蛭仔蛭 生長(zhǎng)。

1.3 繁殖習(xí)性 寬體金線蛭屬于雌雄同體、異體交配的環(huán)節(jié)動(dòng)物。在水溫為14? ℃時(shí)，達(dá)到性成熟的寬體金線蛭會(huì)在安靜的清晨，就近岸疏松土層中進(jìn)行交配 [4]。寬體金線蛭交配受精后，需經(jīng)歷30 d的懷孕期，才開(kāi)始產(chǎn)卵繭 [25]。剛產(chǎn)下的卵繭經(jīng)28 d自然孵化，可孵出幼蛭，每個(gè)卵繭可孵化出16～35條幼蛭 [26]。

2 寬體金線蛭養(yǎng)殖技術(shù)

2.1 養(yǎng)殖模式

2.1.1 池塘養(yǎng)殖。用于養(yǎng)殖寬體金線蛭的池塘分為土泥池和水泥池2種。滲透性好的土池，可用水泥修建成水泥池塘;而對(duì)于滲透性差的地方，可根據(jù)當(dāng)?shù)貙?shí)際情況開(kāi)挖養(yǎng)殖池塘。養(yǎng)殖寬體金線蛭的池塘面積為300～400 m2，水深為 0.8～1.0 m;池壁周邊應(yīng)修建高出池塘水位0.1～0.2 m的平臺(tái)，其寬為0.5～1.0 m;保持平臺(tái)土壤的濕潤(rùn)疏松和豐富腐殖質(zhì)是寬體金線蛭打洞產(chǎn)卵繭的必要條件 [27]。在池底部可放置些小瓦片、碎石塊和種植一些水草等;水面放些浮性水生植物，以供寬體金線蛭棲息 [28]。熊良偉等 [29]研究表明用池塘養(yǎng)殖寬體金線蛭，可收入純利潤(rùn)28.5萬(wàn)元/hm2，獲得了較高的養(yǎng)殖效果。

2.1.2 網(wǎng)箱養(yǎng)殖。用40～50目尼龍網(wǎng)布縫制成網(wǎng)箱;箱體的四邊用4根毛竹或其他柱子作為框架;用泡沫桴子撐起箱頂?shù)乃慕鞘咕W(wǎng)箱向內(nèi)高出水面0.2 m左右，以防止寬體金線蛭逃逸;沉子放于箱底部以固定箱體;用鐵絲將網(wǎng)箱固定于已經(jīng)打好的木樁上;網(wǎng)箱底部與池底保持0.6～0.7 m，使水體交換流通 [30]。在箱底放瓦片、石塊并種植一些綠色水草，供蛭棲息 [31]。養(yǎng)殖過(guò)程中的網(wǎng)箱應(yīng)經(jīng)常清理，并始終保持網(wǎng)箱內(nèi)外水體流通 [32]。

2.1.3 生態(tài)養(yǎng)殖。水生植物與寬體金線蛭間作是一種生態(tài)養(yǎng)殖模式，如蓮藕-水蛭-螺螄、水蛭-田螺-水稻或茭白，具有節(jié)約用地、投資少和經(jīng)濟(jì)效益高等特點(diǎn)。作為生態(tài)養(yǎng)殖池的池埂可高出水面1 m，水深0.8 m，寬3.0 m，而生態(tài)養(yǎng)殖池的長(zhǎng)度可因養(yǎng)殖規(guī)模和地勢(shì)高低而變化;水生植物的種植面積應(yīng)占池塘面積的1/3，以便供寬體金線蛭棲息;在池子邊需用網(wǎng)遮擋住進(jìn)出水口，便于水的排灌以及防止寬體金線蛭逃逸 [33]。李順等 [34]將水蛭與蓮藕混養(yǎng)于667 m2的池塘里，獲得500 kg的水蛭，經(jīng)濟(jì)效益顯著。

2.2 養(yǎng)殖技術(shù)路線 雖然寬體金線蛭的養(yǎng)殖模式諸多，但其養(yǎng)殖的基本技術(shù)路線還是大致相似的，其基本養(yǎng)殖路線如圖1所示。

2.2.1 寬體金線蛭的選擇與放養(yǎng)。引種放養(yǎng)的種蛭一般選擇2齡以上、健康有活力，若用手去觸碰它，它會(huì)立刻皺縮成一團(tuán)者為最佳 [35]。體質(zhì)量為20～30 g的寬體金線蛭適合作種蛭 [36]。新購(gòu)回的種蛭不可直接放到養(yǎng)殖池中，以防止突然的應(yīng)激而造成種蛭死亡 [37]。種蛭放養(yǎng)前應(yīng)清除池內(nèi)雜物并注水10 mL，再用15 kg/hm2的強(qiáng)氯精殺死池中的野生魚(yú)蝦及病原微生物;繁殖小球藻作為螺類的食物 [29]。在4月中旬，可陸續(xù)將親蛭放入養(yǎng)殖池中，待其入池后應(yīng)盡量保持水體環(huán)境良好，且要有充足的浮游動(dòng)物和螺螄類以供寬體金線蛭吸食 [38]。舒斌等 [39]研究發(fā)現(xiàn)寬體金線蛭繁殖時(shí)最佳放養(yǎng)時(shí)段為30～35 d，可提高產(chǎn)卵率。

2.2.2 日常管理。

2.2.2.1 投喂餌料。人工養(yǎng)殖的寬體金線蛭主要攝食鮮活的螺類，其次是以昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)和動(dòng)物血塊作為輔料。在人工養(yǎng)殖過(guò)程中，應(yīng)遵循四定原則，以利于寬體金線蛭正常進(jìn)食和生長(zhǎng)繁殖。寬體金線蛭食用完后應(yīng)及時(shí)將剩余的殘?jiān)謇砀蓛?，避免污染水質(zhì) [38]。

2.2.2.2 防治疾病。若環(huán)境突然變化與飼養(yǎng)密度過(guò)大，會(huì)使生命力頑強(qiáng)的寬體金線蛭增加感染疾病的機(jī)率 [37]。因此需保持池水清潔酸堿適中，保持養(yǎng)殖水溫在20～25 ℃;以養(yǎng)殖池水的水質(zhì)情況作為換水次數(shù)的依據(jù)，若養(yǎng)殖池水的水質(zhì)良好，可15 d左右換一次水;若養(yǎng)殖池水的水質(zhì)較差，需根據(jù)實(shí)際情況勤換水;換水速度不宜過(guò)快，否則過(guò)大的水溫變化會(huì)影響寬體金線蛭的生長(zhǎng) [29]。唐毅等 [40]研究發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖寬體金線蛭時(shí)可以放心選擇的漁藥為二氧化氯和聚維酮碘，而應(yīng)謹(jǐn)慎使用伊維菌素、高錳酸鉀和苯扎溴銨等藥物。在養(yǎng)殖過(guò)程中，每天應(yīng)做到經(jīng)常巡塘，觀察水蛭活動(dòng)情況和水體顏色變化狀況，避免出現(xiàn)問(wèn)題后不能及時(shí)處理。

2.2.3 寬體金線蛭產(chǎn)卵孵化。親蛭交配期間需保持安靜，避免其受到干擾而不能成功交配。親蛭在交配受精后，會(huì)經(jīng)歷30 d左右的懷孕期，30 d后產(chǎn)下卵繭，卵在繭內(nèi)自然孵化 28 d 左右，幼蛭會(huì)破繭而出;孵化過(guò)程中，保持適當(dāng)?shù)臏囟戎陵P(guān)重要，當(dāng)卵繭所處的土壤溫度低于15? ℃時(shí)，所能孵出幼蛭的孵化率極低;25? ℃左右的土壤溫度，能孵出幼蛭的孵出率最高;溫度若超過(guò)35? ℃，則不能孵出幼蛭 [41]。而孵化時(shí)，水位所處的位置是保持孵化溫度的關(guān)鍵。在室外孵化時(shí)，若天氣炎熱應(yīng)向池中注水到產(chǎn)卵時(shí)的水位，否則卵會(huì)干死;若天氣潮濕多雨應(yīng)使水位降到產(chǎn)卵時(shí)的水位，否則卵會(huì)爛掉 [4]。邱楚雯等 [8]研究發(fā)現(xiàn)若維持孵化箱內(nèi)土壤的濕度為30%～40%時(shí)，能使幼蛭的孵出率最佳。幼蛭生長(zhǎng)期間，應(yīng)提供充足的螺類的軟體部分、動(dòng)物的新鮮血塊和原生動(dòng)物等;待每條幼蛭平均體長(zhǎng)為0.15 m以上時(shí)，轉(zhuǎn)入大池進(jìn)行養(yǎng)殖 [38]。

2.2.4 捕獲寬體金線蛭。每年10月份可捕捉寬體金線蛭，其方法是將動(dòng)物的血液灑在草把上經(jīng)晾干后放入水中誘捕寬體金線蛭，一段時(shí)間后將扎草把取出抖下寬體金線蛭，撿大放小，多次重復(fù)上述動(dòng)作即可獲得成蛭 [42]。

2.2.5 寬體金線蛭加工方法。寬體金線蛭干制品質(zhì)量的好壞，會(huì)影響到售價(jià)的高低;干制的水蛭成品一般以自然扁平、易脆易斷且富有光澤者為最佳 [37]。寬體金線蛭的加工方法可歸納為以下3種：①將捕撈的寬體金線蛭埋入石灰中約 0.5 h，然后將死亡的寬體金線蛭曬干，篩出石灰粉即為成品 [25];②用線將捕撈的寬體金線蛭直接懸掛于陽(yáng)光下暴曬;③用煮好的沸水燙死寬體金線蛭，再將燙死的寬體金線蛭撈出洗凈曬干 [27]。

3 水蛭素的分離與純化

水蛭素的傳統(tǒng)提取方法是將水蛭品置于水、有機(jī)溶劑或水與有機(jī)混合的溶劑中進(jìn)行提取 [43]。李寶紅等 [44]采用丙酮、水提醇沉和醇提水沉的方法來(lái)提取水蛭素，并將這3種方法的提取效果進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果表明生物活性最強(qiáng)的水蛭提取物是用水提醇沉的方法提取的。劉洋等 [45]用丙酮提取體蛭的頭部、口部以及蛭體其他位置的水蛭素，以比較3個(gè)不同部位的水蛭素活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蛭體口部的水蛭素抗凝血酶活性最佳，頭部的水蛭素活性是口部的22%，蛭體其他部位的生物活性幾乎為0。通過(guò)以上的比較，在生產(chǎn)中用水提醇沉法來(lái)提取水蛭干制品口部的水蛭素，可提高提取效率，獲得較高的抗凝活性以及提高勞動(dòng)效率，但為防止浪費(fèi)，可將蛭體口部以外的其他部位作為中藥材入藥。Shan等 [46]為了確定水提法和仿生法對(duì)寬體金線蛭體內(nèi)活性成分的影響，分別用仿生法和水提法從懸掛干蛭品、滑石粉油炸蛭品及乙醇浸泡后烘干蛭品中提取抗凝活性物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用水提法從懸掛干蛭品中提取的活性成分抗凝血作用最強(qiáng)，乙醇浸泡后烘干蛭品次之，滑石粉油炸蛭品最弱;用仿生法從乙醇浸泡后烘干蛭品中提取的活性成分抗凝作用強(qiáng)，滑石粉油炸蛭品次之，懸掛干蛭品最弱。由此可見(jiàn)，對(duì)于不同的蛭品應(yīng)考慮合適的提取方法。水蛭材料的不同也會(huì)影響提取效果，從活的蛭體中分離提取的水蛭素具有活性較強(qiáng)、純度較高、還可以反復(fù)提取利用的優(yōu)點(diǎn)，但從活體蛭體中分離水蛭素的操作難度大，因此在操作時(shí)，應(yīng)避免傷害到蛭體，而影響下次提取;從干制品中分離提取水蛭素時(shí)，操作較簡(jiǎn)便，但水蛭素的純度和活性不是很高 [47]。李濯冰等 [48]用傳統(tǒng)提取方法與酶解提取法對(duì)水蛭素進(jìn)行提取，并將所提取的水蛭素進(jìn)行活性效果比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶解提取法優(yōu)于傳統(tǒng)提取法。酶解提取法雖然比傳統(tǒng)提取法效果較佳，但成本相對(duì)較高。

使用科學(xué)合理的純化技術(shù)是水蛭素活性物質(zhì)有效利用的前提，離子交換和凝膠過(guò)濾層析法是目前主要的純化方法。段超等 [49]先采用仿生法對(duì)鮮活水蛭進(jìn)行誘導(dǎo)，再用超濾膜透析法對(duì)誘導(dǎo)獲得的蛭體唾液進(jìn)行分離，可得到純度為92%的水蛭素。陳曦等 [50]通過(guò)先后使用陰離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析的方法，能從35 g的水蛭粗品中得到5 g較純的天然水蛭素，其總活力為2 250 IU。

4 水蛭素活性測(cè)定

目前測(cè)定水蛭素活性的方法主要有凝血酶滴定改進(jìn)法、發(fā)色底物吸光值變化率法、纖維蛋白平板法及光散射法 [51]。不同的水蛭素活性測(cè)定方法有優(yōu)點(diǎn)也有缺點(diǎn)，在選擇水蛭素活性測(cè)定方法時(shí)可根據(jù)已有的條件，選擇合適的測(cè)定方法。陳華友等 [52]通過(guò)配制不同倍數(shù)的凝血酶溶液來(lái)縮小所測(cè)水蛭素的活性范圍，此方法簡(jiǎn)便又省時(shí)，且重復(fù)性和準(zhǔn)確度好。

趙榮樂(lè) [53]采用發(fā)色底物吸光值變化法測(cè)定水蛭素的活性，此方法靈敏度和準(zhǔn)確度都較高，但需配備昂貴的儀器。

班建東等 [54]采用纖維蛋白原平板的方法來(lái)測(cè)定水蛭素的活性，此方法成本低、操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度好，但比較耗時(shí)。

周靚等 [55]在已繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線上尋找最高斜率處的水蛭素光散射強(qiáng)度每分鐘變化值的對(duì)應(yīng)值，此方法操作簡(jiǎn)單、成本低、準(zhǔn)確性好，還可以較好地觀察到反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。

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