盧麗蓉

（華寧縣土壤肥料工作站，云南華寧 652800）

鐵皮石斛為蘭科石斛屬植物，是一種名貴的中藥材，含有石斛堿、多種人體所需的微量元素和氨基酸等有效成分，在抗腫瘤、抗氧化、提高人體免疫力、治療胃腸道疾病等方面均有良好的效果。近年來隨著人工種植面積的擴(kuò)大和年限延長，病害普遍發(fā)生，其中由鏈格孢引起的石斛黑斑病最為嚴(yán)重。

水楊酸是植物體內(nèi)產(chǎn)生的小分子酚類化合物，參與多種生理過程的調(diào)節(jié)。在植物抗病反應(yīng)中它涉及并參與了植物的過敏性壞死和系統(tǒng)獲得性抗病性反應(yīng)，其誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性的生理作用備受專家學(xué)者關(guān)注。因此試驗(yàn)用不同濃度SA處理對(duì)鐵皮石斛黑斑病的誘抗效果，篩選最佳誘導(dǎo)濃度、最佳間隔期及持久性，為水楊酸誘導(dǎo)抗鐵皮石斛黑斑病田間防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

采用鐵皮石斛組培苗（壯苗生根培養(yǎng)3個(gè)月）；鐵皮石斛黑斑病病原菌-細(xì)極鏈格孢為供試菌種；PCA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，胡蘿卜200 g，瓊脂18 g，蒸餾水1000 mL）；水楊酸（SA）；聚山梨酯80。

1.2 方 法

1.2.1 鐵皮石斛適應(yīng)性培養(yǎng)

表1 不同濃度水楊酸處理對(duì)鐵皮石斛黑斑病的影響比較

注：“-”表示無，同一列不同小寫字母表示差異顯著（p＜0.05），下同

表2 不同間隔期對(duì)鐵皮石斛黑斑病的影響比

將石斛組培苗于溫度25℃、光照強(qiáng)度1000～2000 lx，濕度70 %～80 %下培養(yǎng)1個(gè)月后，選擇健壯、長勢(shì)一致的植株試驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)極鏈格孢孢子懸浮液的制備

將分離純化后的供試菌種轉(zhuǎn)接于PCA培養(yǎng)基上，于25 ℃光照（L∶D = 12∶12）的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d。用無菌水洗脫細(xì)極鏈格孢孢子，制成每毫升6×106個(gè)孢子懸浮液。

1.2.3 SA誘導(dǎo)鐵皮石斛抗黑斑病的最佳濃度篩選

（1）試驗(yàn)處理。SA配制成每升濃度分別為0.5 mol、1.0 mol、1.5 mol、2.0 mol、2.5 mol，pH 值 接近中性加入0.05 %（聚山梨酯80）的水溶液。用喉頭噴霧器將不同濃度的SA噴施于鐵皮石斛葉片上（葉片正面和背面都均勻噴霧），以葉片均布、藥液不流淌為度。設(shè)無菌水加0.05 %聚山梨酯80噴霧處理為對(duì)照。12 h后采用針刺法將每毫升6×106個(gè)細(xì)極鏈格孢孢子懸浮液（即孢子懸浮液）10 μL接種于鐵皮石斛健壯葉片中部，每種濃度及對(duì)照接種10片，接種后避光保濕24 h。30 d后調(diào)查植物的病斑大?。ㄒ云骄怠罉?biāo)準(zhǔn)誤表示，下同），計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)及誘抗效果。

（2）黑斑病病斑的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

0級(jí) 針刺處無病斑；

1級(jí) 針刺處無明顯病斑，病斑擴(kuò)展直徑小于1 mm；

2級(jí) 病斑向四周擴(kuò)展直徑為1～3 mm；

3級(jí) 病斑向四周擴(kuò)展直徑為3～6 mm，周圍有輕微泛黃；

4級(jí) 病斑面積達(dá)到葉片的1/4，但小于1/2，并周圍有枯黃；

5級(jí) 病斑面積大于葉片的1/2，或葉片大面積枯黃或全部枯黃。

（3）計(jì)算公式。

發(fā)病率＝（病葉數(shù)／調(diào)查總?cè)~數(shù)）×100 %病情指數(shù)＝（∑病級(jí)葉數(shù)×該病級(jí)值／調(diào)查總?cè)~片數(shù)×最高級(jí)數(shù)值）×100%

誘抗效果以病情指數(shù)下降百分率表示，即誘抗效果＝（對(duì)照病情指數(shù)－處理病情指數(shù)）／對(duì)照病情指數(shù)×100 %

1.2.4 SA最佳濃度處理后間隔期及抗病持久性篩選

根據(jù)SA誘導(dǎo)鐵皮石斛抗黑斑病的最佳濃度篩選，獲得SA最佳誘導(dǎo)濃度。將最佳濃度SA溶液加入0.05 %聚山梨酯80，噴施于鐵皮石斛葉片上（葉片正面和背面都均勻噴霧），以葉片均布、藥液不流淌為度。設(shè)無菌水加0.05 %聚山梨酯80噴霧處理為對(duì)照。分別于噴藥后第1～10 d用針刺法將每毫升6×106個(gè)10 μL的細(xì)極鏈格孢孢子懸浮液接種于鐵皮石斛健壯葉片中部，每種間隔期及對(duì)照接種10片，接種后避光保濕24 h。接種10 d后統(tǒng)計(jì)植物的病斑大小，計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)及誘抗效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 SA誘導(dǎo)鐵皮石斛抗黑斑病的最佳濃度

由表1知，在有輕微傷口的葉片上接種細(xì)極鏈格孢，植株發(fā)病率接近100.00 %，病斑呈圓形或近圓形，病斑周圍葉片變黃。用0.5～2.0 mmol/L 的SA處理能有效誘導(dǎo)鐵皮石斛對(duì)黑斑病產(chǎn)生抗性，其中在1.0 mmol/L的 SA處理下病斑擴(kuò)展最小，病情指數(shù)最低，誘抗效果達(dá)76.00 %，與對(duì)照及其他濃度處理差異顯著，因此篩選出SA誘導(dǎo)鐵皮石斛抗黑斑病的最佳濃度為1.0 mmol/L。

2.2 SA誘導(dǎo)鐵皮石斛抗黑斑病的最佳間隔期和持久期

用1.0 mmol/L 的SA處理鐵皮石斛葉片，不同間隔期對(duì)鐵皮石斛黑斑病產(chǎn)生不同的誘抗效果（表 2）。

由表2知，SA處理1 d后接種病原菌就表現(xiàn)出誘抗效果，間隔5 d后接種病斑擴(kuò)展最小，病情指數(shù)最低，誘抗效果達(dá)到80.00 %，與對(duì)照、間隔1 d、6 d、7d、10 d接種的病斑大小差異顯著。因此，1.0 mmol/L 的SA誘導(dǎo)鐵皮石斛抗黑斑病間隔時(shí)間以5 d為最佳。間隔10 d接種，其病斑大小與對(duì)照接近，病情指數(shù)與對(duì)照相等，誘抗效果為0.00%，表明SA誘導(dǎo)鐵皮石斛抗黑斑病的持久期可達(dá)10 d。

3 結(jié) 論

試驗(yàn)結(jié)果顯示，SA濃度為1.0 mmol/L處理可以達(dá)到最好的誘抗效果，同時(shí)SA最佳濃度對(duì)細(xì)極鏈格孢生長及孢子萌發(fā)無直接的抑制作用，表明SA是通過誘導(dǎo)鐵皮石斛產(chǎn)生抗性起作用，而非SA抑制了細(xì)極鏈格孢的活性。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，用0.5～2.0 mmol/L的SA處理都能有效誘導(dǎo)鐵皮石斛對(duì)黑斑病產(chǎn)生抗性，而2.5 mmol/L的SA處理后，病情指數(shù)與對(duì)照相等，誘抗效果為0.00%，因此SA誘導(dǎo)鐵皮石斛抗黑斑病的濃度并不是越高越好，高濃度的SA不但不能提高植物的抗病性，反而使植物更容易感病，這與王媛的研究結(jié)果是一致的，王媛用10 mmmol/L的SA噴施擬南芥葉片接種灰霉菌后8 d，其發(fā)病率和病情指數(shù)都高于對(duì)照。所以同植物正常的抗病性一樣，誘導(dǎo)抗性產(chǎn)生如果處理不當(dāng)，也會(huì)產(chǎn)生負(fù)面作用。

用1.0 mmol/L的SA處理鐵皮石斛植株，分別于噴施后第1～10 d（每天）接種細(xì)極鏈格孢，接種10 d后記錄病情，結(jié)果顯示SA處理1d后接種病原菌就表現(xiàn)出誘抗效果，并在1～9 d的測(cè)定時(shí)間內(nèi)都表現(xiàn)出對(duì)黑斑病的抗性，說明SA誘導(dǎo)鐵皮石斛抗黑斑病具有很好的持久性。其中間隔5 d接種的病斑擴(kuò)展最小，病情指數(shù)最低，誘抗效果達(dá)到80.00%。表明誘導(dǎo)抗性的產(chǎn)生需要一定時(shí)間，噴施水楊酸后，只有當(dāng)寄主體內(nèi)某些代謝發(fā)生變化后，或某種“信息”傳導(dǎo)后，植物才表現(xiàn)出對(duì)病害的抗性。因此在鐵皮石斛黑斑病田間防治中，建議在病害發(fā)生之前就噴施水楊酸，這樣才能起到良好的防治效果。