王延召，周 波，韓小花，黃 保，魯曉民，程軍玲，王淑鳳，聶利紅

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所，河南 鄭州 450002； 2.禹州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河南 禹州451670； 3河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所，河南 鄭州 450002)

GATA轉(zhuǎn)錄因子是真核生物中一類(lèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，是含有高度保守的Ⅳ鋅指結(jié)構(gòu)域的反式作用因子，他們可以特異性結(jié)合含有GATA的DNA序列WGATAR(W為T(mén)或者 A，R為G 或者 A)，從而調(diào)控下游基因的表達(dá)，所以被稱(chēng)為GATA轉(zhuǎn)錄因子[1]。植物中的大多數(shù)GATA轉(zhuǎn)錄因子包括1個(gè)或2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域，其共有序列為CX2CX18—20CX2C[2-3]。EVANS等[4]于1988 年發(fā)現(xiàn)6個(gè)GATA轉(zhuǎn)錄因子可以與雞珠蛋白基因啟動(dòng)子的(T/A)GATA(A/G)序列結(jié)合。1993年，在煙草中鑒定出了第一個(gè)植物GATA轉(zhuǎn)錄因子NTL1，具有CX2CX18CX2C氨基酸序列[5]。REYES 等[2]2004年在擬南芥基因組中鑒定到30個(gè)GATA基因，根據(jù)氨基酸序列的相似性分成4組。伴隨著許多植物基因組參考序列的公開(kāi)發(fā)表，近幾年，在大豆[3]、葡萄[6]、棉花[7]中分別鑒定到64、19 、179 個(gè)GATA基因，為全基因組范圍內(nèi)深入研究這些作物中GATA轉(zhuǎn)錄因子的具體功能奠定了基礎(chǔ)。

研究表明，許多GATA轉(zhuǎn)錄因子在植物抵御非生物脅迫過(guò)程中具有重要作用[8-10]。MUKHOPADHYAY等[8]發(fā)現(xiàn)，在煙草中過(guò)表達(dá)水稻GATA基因OsISAP1(Oryzasativasubsp.indicastress-associated protein 1)，提高了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)低溫、脫水和鹽脅迫的耐受性。BHARDWAJ等[9]通過(guò)RNA-Seq在芥菜型油菜中篩選出29個(gè)應(yīng)答高溫和干旱脅迫的GATA基因。KANG等[10]研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)GATA基因OsZFP350的轉(zhuǎn)基因水稻植株的主根長(zhǎng)度、不定根和側(cè)根數(shù)量顯著增加，非生物脅迫條件下種子的發(fā)芽率顯著提高，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)熱、鹽和干旱脅迫的耐受性提高。

玉米是世界上重要的糧食作物，其生長(zhǎng)過(guò)程中受到許多非生物脅迫的危害，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量。近年來(lái)，由于氣候變化，全球溫度升高，極端天氣頻發(fā)，導(dǎo)致許多農(nóng)作物遭受著日益嚴(yán)重的熱脅迫。目前，玉米中關(guān)于GATA轉(zhuǎn)錄因子全因組鑒定及其應(yīng)答熱脅迫的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，對(duì)玉米GATA基因家族成員進(jìn)行鑒定，并對(duì)其理化特征、染色體分布、保守基序和應(yīng)答熱脅迫的表達(dá)水平進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究GATA轉(zhuǎn)錄因子功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

玉米參考基因組序列、基因結(jié)構(gòu)信息及蛋白質(zhì)序列文件下載自Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫(kù)(ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-46)。

1.2 玉米基因家族成員的鑒定及生物信息學(xué)分析

GATA家族成員結(jié)構(gòu)域隱馬爾科夫模型(PF00320)下載自Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pfam.xfam.org/)。首先，利用HMMER 3.1軟件[11]結(jié)合GATA家族成員結(jié)構(gòu)域隱馬爾科夫模型搜索玉米基因組功能蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)，E值設(shè)置為 1E-10。其次，如果同一個(gè)基因?qū)?yīng)的多個(gè)蛋白質(zhì)序列被鑒定到，只保留氨基酸長(zhǎng)度最長(zhǎng)的蛋白質(zhì)序列作為被鑒定到的GATA基因家族成員。為確認(rèn)所預(yù)測(cè)基因?yàn)镚ATA基因家族成員的可靠性，利用SMART(http://smart.embl.de/)進(jìn)一步驗(yàn)證GATA保守結(jié)構(gòu)域的完整性。利用ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)來(lái)預(yù)測(cè)玉米GATA家族蛋白的理化特性。

1.3 玉米GATA基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建及染色體分布

通過(guò)MEGA 7.0軟件[12]包中的MUSCLE 軟件對(duì)鑒定到的玉米GATA基因家族成員氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì),然后采用NJ(Neighbor joining)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap值設(shè)置為1 000。提取玉米已知基因位置坐標(biāo)信息并用MapInspect軟件繪制GATA基因家族成員染色體分布圖。

1.4 玉米GATA家族基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析

從數(shù)據(jù)庫(kù)中提取鑒定到的GATA基因結(jié)構(gòu)注釋信息,然后將其提交GSDS網(wǎng)站(http://gsds.cbi.pku.edu.cn)繪制基因結(jié)構(gòu)圖[13]。用MEME軟件(http://meme-suite.org/tools/meme)預(yù)測(cè)GATA基因家族成員的保守結(jié)構(gòu)域[14]。

1.5 玉米GATA基因家族的表達(dá)分析

玉米轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)下載自NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為SRX5057980—SRX5057997。采用HISAT 2.0.1軟件[15]與玉米參考基因組序列進(jìn)行比對(duì)，運(yùn)用HTSeq 0.6.1軟件[16]統(tǒng)計(jì)每個(gè)轉(zhuǎn)錄單元的reads數(shù)，每個(gè)基因相對(duì)表達(dá)水平通過(guò)FPKM值來(lái)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米GATA基因家族成員的鑒定及染色體分布

通過(guò)對(duì)已公布玉米全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索以及SMART 在線數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證，在玉米基因組中共鑒定到37個(gè)GATA 基因家族成員(表1)。玉米GATA基因編碼的氨基酸數(shù)在139～760個(gè)；編碼蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為14 865.88～86 748.42 u；等電點(diǎn)為4.61～10.23，其中12個(gè)為酸性蛋白質(zhì)(等電點(diǎn)<7.0)，25個(gè)為堿性蛋白質(zhì)(等電點(diǎn)>7.0)；不穩(wěn)定指數(shù)介于45.52～77.46，均為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)(不穩(wěn)定指數(shù)大于40)；親水性平均系數(shù)均為負(fù)數(shù)，表明玉米GATA 蛋白均為親水性蛋白。

表1 玉米GATA基因家族成員理化性質(zhì)Tab.1 The physicochemical properties of GATA gene family in maize

由圖1可知，37個(gè)玉米GATA基因在10條染色體上不均勻分布，8號(hào)染色體上最多，含有6個(gè)基因；其次是1號(hào)、4號(hào)和5號(hào)染色體，均含有5個(gè)基因；6號(hào)和10號(hào)染色體分別含有4個(gè)基因；9號(hào)染色體上含有3個(gè)基因；2號(hào)和3號(hào)染色體分別含有2個(gè)基因；7號(hào)染色體上最少，只鑒定到1個(gè)基因。其中，4號(hào)染色體上的4個(gè)基因(Zm00001d052412和Zm00001d052413，Zm00001d052430和Zm00001d052431)分布在同一染色體上相鄰的位置，說(shuō)明可能有串聯(lián)重復(fù)產(chǎn)生。

圖1 玉米GATA 基因的染色體分布Fig.1 Chromosomal distribution of GATA genes in maize

2.2 玉米GATA基因家族成員進(jìn)化分析

本研究將鑒定到的玉米GATA基因家族成員氨基酸序列與已知擬南芥GATA基因家族成員氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)已知擬南芥GATA基因家族成員進(jìn)化分類(lèi)信息對(duì)玉米GATA基因家族進(jìn)行分類(lèi)(圖2)，玉米GATA基因家族可以分為4組(A、B、C、D)，其中A組包含21個(gè)家族成員，占玉米GATA基因家族總數(shù)的1/2以上；B、 C、D組分別含有10、4、2個(gè)家族成員。

圖2 玉米GATA基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of GATA genes in maize

2.3 玉米GATA基因家族成員基因結(jié)構(gòu)和保守域分析

由圖3可知，玉米GATA家族基因含有1～8個(gè)外顯子，其中，A組含有1～3個(gè)外顯子；B組的4個(gè)基因含有2個(gè)外顯子，6個(gè)基因含有3個(gè)外顯子；C組的4個(gè)基因(Zm00001d033523、Zm00001d013331、Zm00001d036494和Zm00001d014656)含有7～8個(gè)外顯子，說(shuō)明同一組的基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)具有很強(qiáng)的一致性。另外，對(duì)37個(gè)玉米GATA基因家族成員保守基序分析表明，它們均含有1個(gè)CX2CX18CX2C保守基序(圖4)。

圖3 玉米GATA基因家族成員基因結(jié)構(gòu)Fig.3 Gene strutures of GATA gene family in maize

圖4 玉米GATA基因家族保守基序Fig.4 Conserved motif of GATA gene family in maize

2.4 玉米GATA基因家族成員應(yīng)答熱脅迫的表達(dá)分析

對(duì)玉米3個(gè)品系的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析(圖5)發(fā)現(xiàn)，玉米GATA家族37個(gè)基因中有20個(gè)基因在3個(gè)樣品中均有表達(dá)，包括A組10個(gè)、B組6個(gè)、C組3個(gè)、D組1個(gè)。其中，特異應(yīng)答熱脅迫的GATA家族基因有11個(gè)，表達(dá)上調(diào)的基因有9個(gè)，包含A組5個(gè)(Zm00001d010785、Zm00001d023539、Zm00001d041883、Zm00001d025953和Zm00001d031135)，B組2個(gè)(Zm00001d011771和Zm00001d034751)，C組2個(gè)(Zm00001d036494和Zm00001d014656)；表達(dá)下調(diào)的基因有2個(gè)，都?xì)w屬于B組(Zm00001d016361和Zm00001d009193)。綜上所述，在熱脅迫處理后，玉米GATA基因家族不同亞組中的不同成員的表達(dá)是有差異的，這說(shuō)明GATA基因家族在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中不同成員的功能是有差異的。

CF、CM、CQ表示對(duì)照樣品，F(xiàn)、M、Q分別表示CF、CM、CQ對(duì)應(yīng)的熱脅迫后樣品CF,CM,andCQ represent three genotypes under control conditions,respectively; F,M and Q represent the corresponding genotypes under heat treatment.

3 結(jié)論與討論

研究表明，GATA 轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育、氮素代謝、抗逆及真菌次生代謝等方面發(fā)揮重要的作用[17-20]。本研究首次從玉米基因組中鑒定到37個(gè)GATA基因，編碼的蛋白質(zhì)均為親水性蛋白，在10條染色體上呈現(xiàn)不均勻分布。聚類(lèi)分析表明，玉米GATA基因家族可以分為4組(A、B、C、D)，同一組內(nèi)的基因具有相似的基因結(jié)構(gòu)。他們均含有一個(gè)CX2CX18CX2C保守基序，這與擬南芥中報(bào)道結(jié)果一致[2]。RNA-Seq分析結(jié)果表明，有11個(gè)GATA基因在應(yīng)答熱脅迫處理后表達(dá)水平發(fā)生了變化，其中表達(dá)上調(diào)的基因有9個(gè)，包含A組5個(gè)(Zm00001d010785、Zm00001d023539、Zm00001d041883、Zm00001d025953、Zm00001d031135)，B組2個(gè)(Zm00001d011771、Zm00001d034751)，C組2個(gè)(Zm00001d036494、Zm00001d014656)；下調(diào)的基因有2個(gè)，屬于B組(Zm00001d016361、Zm00001d009193)，說(shuō)明上調(diào)表達(dá)的這9個(gè)GATA基因在應(yīng)答熱脅迫過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。