杭州市中醫(yī)院 浙江 杭州 310007

肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體1（PepT1）主要表達(dá)于小腸刷狀緣膜上,是蛋白質(zhì)消化產(chǎn)物小分子肽（二肽、三肽）在小腸吸收的主要轉(zhuǎn)運(yùn)體。因此，PepT1的表達(dá)和功能直接影響蛋白質(zhì)消化產(chǎn)物的吸收水平[1-3]。PepT1的底物很多，以β-內(nèi)酰氨類抗生素頭孢羥氨芐（Cefadroxil）最為常用，PepT1對(duì)頭孢羥氨芐具有與二肽、三肽相同的底物特異性。即頭孢羥氨芐在腸道內(nèi)的吸收機(jī)理與二肽一樣，均是通過 PepT1轉(zhuǎn)運(yùn)，而且頭孢羥氨芐在腸道吸收后由于缺乏相應(yīng)的降解酶而幾乎不被降解［4-5］，因此，許多關(guān)于PepT1的研究都以頭孢羥氨芐為底物［6-7］。

四君子湯由人參、炙甘草、茯苓和白術(shù)4味藥物組成，其主要功用是健脾益氣，常用于治療脾胃虛弱、運(yùn)化無(wú)力等癥，為治療脾虛證的基礎(chǔ)方。本研究以頭孢羥氨芐為PepT1的底物，研究了脾虛模型大鼠服用四君子湯對(duì)PEPT1的表達(dá)和功能的影響。通過測(cè)定四君子湯對(duì)PepT1轉(zhuǎn)運(yùn)功能及蛋白、mRNA表達(dá)、底物的血藥濃度的影響，以期為科學(xué)指導(dǎo)臨床中西藥合理聯(lián)藥提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品：黨參、白術(shù)、茯苓、甘草購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠。以上四味藥材按3∶3∶3∶2的比例混合后，加10倍量水煎煮2次，每次1小時(shí)，合并濾液后濃縮，冷藏過夜，離心，取上清液稀釋至2g藥材/ml，作為四君子湯藥液。

1.2 儀器與試劑：安捷倫高效液相色譜儀（Agilent 1200）；臺(tái)式高速冷凍型微量離心機(jī)（D3024R，Dragon‐Lab）；熒光定量PCR儀（Stepone plus，ABI）；超微量分光光度計(jì)（NanoDrop2000，Thermo）；利血平（Reserpine,Sigma,Lot WXBC4865V）；PepT1抗體（ABACM，Ab203043）；頭孢羥氨芐標(biāo)準(zhǔn)品cefadroxil（中國(guó)食品藥品檢定研究院，130431-201203）；頭孢羥氨芐片(清遠(yuǎn)華能制藥有限公司，20161016)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及給藥：將SD雄性大鼠50只（體重200g左右）隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為正常對(duì)照組，模型組，高、中、低劑量治療組。正常對(duì)照組每日股四頭肌注射生理鹽水0.1ml/只，連續(xù)14天，并于當(dāng)天灌服生理鹽水2ml/只，連續(xù)14天。模型組和三組治療組每日股四頭肌注射利血平注射液0.5ml/Kg，連續(xù)14天，建立脾虛模型。模型組在造模當(dāng)天灌服生理鹽水2ml/只，連續(xù)14天。高中低劑量組在造模當(dāng)天分別灌服四君子湯藥液2ml、1ml、0.5ml/100g，連續(xù)14天。第15天禁食后每組大鼠灌服頭孢羥氨芐200mg/Kg，于給藥后0.5、1、1.5、2、4h、6h、8h眼眶取血，肝素抗凝管制備血漿，-80℃保存?zhèn)溆?。處死大鼠，立即取十二指腸下15cm處小腸段5cm，DEPC處理水清洗3次后冰上刮取黏膜，放入凍存管中液氮保存，用于PepT1 mRNA檢測(cè)；在幽門下20cm處剪取小腸段2cm，冰生理鹽水清洗后中性甲醛固定20h，用于PepT1蛋白免疫組化檢測(cè)。

2.2 頭孢羥氨芐吸收的測(cè)定：分述如下。

2.2.1 色譜條件：色譜柱（Agilent XDB-C18 150mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇：水（含0.01M磷酸二氫鈉）＝13∶87（V∶V）；檢測(cè)波長(zhǎng)：260nm；柱溫：35℃；流速：1ml·min-1；進(jìn)樣量20μl。

2.2.2 樣品制備：精密量取血漿0.1ml，加入0.1ml 6%高氯酸溶液，震蕩1min，低溫離心5min（12000rpm），取上清液即為供試品溶液。

2.2.3 線性關(guān)系的考察：將一定量的頭孢羥氨芐標(biāo)準(zhǔn)品溶解于一定量的蒸餾水中，配成8種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取空白血漿90μl，加入以上標(biāo)準(zhǔn)溶液10μl，按“2.2.2”的方法操作后進(jìn)行樣品分析，設(shè)進(jìn)樣濃度值為X，峰面積值為Y，用加權(quán)（W=1/C2）最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，得線性回歸方程：Y＝0.1137X-4.0078，r＝0.9997，線性范圍0.6375-81.6μg?ml-1，最低檢出濃度為：0.6375μg?ml-1（以S/N≥3計(jì)）。

2.2.4 精密度：低、中、高按濃度樣品的日內(nèi)精密度RSD為1.35%、0.98%、1.09%，日間精密度RSD為1.79%、1.52%、1.45%，精密度達(dá)到分析要求。

2.2.5 重復(fù)性：取同一血漿樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下操作，平行操作5次，得5份供試品溶液，在“2.2.1”條件下進(jìn)行含量測(cè)定，RSD小于5%。

2.2.6 加樣回收率：精密量取已知濃度的血漿樣品90μl，共9份，每3份為一水平，分別精密加入頭孢羥氨芐標(biāo)準(zhǔn)溶液102、204、408μg?ml-110μl，按“2.2.2”項(xiàng)下操作，在“2.2.1”色譜條件下進(jìn)行分析，平均回收率為94.75%，RSD為3.63%。

2.3 小腸黏膜PepT1表達(dá)的影響：采用免疫組織化學(xué)法，按照試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行免疫組化染色。顯示蘇木素染細(xì)胞核為藍(lán)色，DAB顯出的PEPT1陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色。每組內(nèi)每張切片隨機(jī)挑選至少3個(gè)200倍視野進(jìn)行拍照。拍照時(shí)盡量讓組織充滿整個(gè)視野，保證每張照片的背景光一致。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件選取相同的棕黃色作為判斷所有照片陽(yáng)性的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)每張照片進(jìn)行分析得出每張照片陽(yáng)性的累積光密度值（IOD）以及組織的像素面積（AREA）。并求出平均光密度值（average optical,AO值），AO=IOD/AREA，AO值越大表明陽(yáng)性表達(dá)水平越高。

2.4 小腸黏膜PepT1mRNA表達(dá)的檢測(cè)：應(yīng)用熒光定量PCR法對(duì)小腸黏膜 PepT1 mRNA表達(dá)進(jìn)行定量。取小腸黏膜用Trizol法提取總RNA后逆轉(zhuǎn)錄為CDNA，按照實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行操作，檢測(cè)PepT1的mRNA表達(dá)水平，引物序列見表1。擴(kuò)增程序?yàn)轭A(yù)變性，95℃，10min；循環(huán)（40次），95℃，15s→60℃，60s；熔解曲線，60℃→95℃，每15s升溫0.3℃。以GAPDH為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用2一△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。

表1 PCR引物

3 結(jié)果

3.1 血漿頭孢羥氨芐濃度經(jīng)時(shí)變化：各組大鼠灌服頭孢羥氨芐30min后，血中即可檢測(cè)到較高濃度的頭孢羥氨芐，達(dá)峰時(shí)間在1h左右。0～4h，與正常組相比，模型組血藥濃度明顯增加（P＜0.01）；用藥后，高劑量組和中劑量組血藥濃度與模型組相比顯著下降（P＜0.01），與正常組接近；低劑量組無(wú)明顯變化。見圖1。

圖1 各組平均血藥濃度-時(shí)間曲線

3.2 四君子湯對(duì)小腸黏膜PepT1表達(dá)的影響：模型組大鼠PepT1蛋白表達(dá)與正常組比較，呈明顯上調(diào)（P＜0.01）。與模型組比較，四君子湯高劑量組和中劑量組蛋白表達(dá)顯著下降(P＜0.01),其中高劑量組與正常組接近（P＞0.05）；低劑量組與模型組相比，蛋白表達(dá)也下調(diào)，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。見表2、圖2。

表2 四君子湯對(duì)大鼠小腸上皮PepT1表達(dá)的影響（±s，n=10）

表2 四君子湯對(duì)大鼠小腸上皮PepT1表達(dá)的影響（±s，n=10）

注：與正常組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

AO值0.004030±0.001031 0.1165±0.002442△△0.004827±0.001083**0.006381±0.0009205**0.009401±0.002531組別正常組模型組高劑量組中劑量組低劑量組

圖2 免疫組化方法測(cè)定小腸黏膜PepT1表達(dá)

3.3 四君子湯對(duì)大鼠小腸黏膜PepT1 mRNA表達(dá)的影響：應(yīng)用熒光定量PCR法對(duì)小腸黏膜 PepT1 mRNA表達(dá)進(jìn)行定量，模型組大鼠PepT1 mRNA表達(dá)量相對(duì)于正常組略有升高，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；用藥之后，四君子湯高、中、低劑量組大鼠PepT1 mRNA表達(dá)量相對(duì)于模型組略有升高，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05），相對(duì)于正常組都有升高，高、中劑量組有顯著性差異（P＜0.01，P＜0.05）。

圖3 PCR法測(cè)定小腸黏膜PepT1 mRNA結(jié)果

4 討論

脾虛狀態(tài)下，脾主運(yùn)化功能障礙，小腸對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)功能降低，但是本實(shí)驗(yàn)中脾陽(yáng)虛模型組大鼠頭孢羥氨芐的血藥濃度與正常組比較顯著性升高，模型組大鼠小腸黏膜上皮細(xì)胞刷狀膜囊緣上PepT1陽(yáng)性表達(dá)比正常組顯著增加。有研究認(rèn)為，在小腸吸收功能出現(xiàn)障礙或整體蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)吸收低下的情況下，二肽轉(zhuǎn)運(yùn)比氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)更有效[8]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致，可以理解為在脾虛狀態(tài)下，小腸對(duì)二肽吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的增加是一種病理狀態(tài)下的應(yīng)激反應(yīng)，是對(duì)小腸氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)不足而造成的營(yíng)養(yǎng)不良的一種代償狀態(tài)。與模型組比較治療后高劑量組和中劑量組蛋白表達(dá)顯著下降(P＜0.01)，對(duì)二肽的吸收減少，因此頭孢羥氨芐的血藥濃度下降，高劑量組與正常組接近（P＞0.05），而低劑量組相對(duì)模型組無(wú)明顯變化，說(shuō)明在本實(shí)驗(yàn)中，四君子湯可使脾虛大鼠異常升高的Pep T1蛋白表達(dá)趨于正常，且呈劑量依賴性。

本試驗(yàn)中模型組PepT1陽(yáng)性表達(dá)增加了，但PepT1的mRNA水平并沒有顯著升高。有報(bào)道小腸黏膜上皮細(xì)胞刷狀膜囊緣上PepT1蛋白才是具有轉(zhuǎn)運(yùn)活性的功能蛋白，在細(xì)胞池內(nèi)還存在不具有轉(zhuǎn)運(yùn)活性的PepT1蛋白[9]。有研究發(fā)現(xiàn)用TNF-α，IFN-γ等炎癥因子處理后PepT1表達(dá)增加，但是PepT1 mRNA并沒有增加，提示細(xì)胞膜上PepT1蛋白表達(dá)的增加是轉(zhuǎn)錄后變化[10]。通過本實(shí)驗(yàn)，初步可以得出，用藥后小腸黏膜上皮細(xì)胞刷狀膜囊緣上PepT1蛋白表達(dá)的增加，只是促進(jìn)了轉(zhuǎn)運(yùn)載體從細(xì)胞池到細(xì)胞膜上的移位增加，而不是從頭合成增加。