王瑞營,張 娟,王 碧,侯亞文,吳斌艷,扈會整

(陜西省核工業(yè)二一五醫(yī)院檢驗(yàn)科,中國陜西咸陽712000)

細(xì)菌進(jìn)化出多種結(jié)構(gòu)與周圍環(huán)境進(jìn)行交流,分泌系統(tǒng)就是其中之一。利用分泌系統(tǒng),細(xì)菌可以獲得營養(yǎng)、向外部環(huán)境分泌毒力因子以及直接靶向真核細(xì)胞使其致病。到目前為止,人們已在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)9套分泌系統(tǒng)(T1SS～T9SS)[1～2],2006年由Pukatzki等[3]研究小組命名的Ⅵ型分泌系統(tǒng)(typeⅥsecretion system,T6SS)是近幾年來研究較多的一種分泌系統(tǒng)。銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)包含進(jìn)化上完全不同的3種基因簇 H1-T6SS、H2-T6SS、H3-T6SS,這使銅綠假單胞菌成為研究T6SS的理想模式生物[4～5]。

銅綠假單胞菌又稱綠膿桿菌,是一種常見的人類機(jī)會致病菌,在人群中可以引起嚴(yán)重的急性和慢性感染[6]。銅綠假單胞菌的易感人群主要有燒傷、經(jīng)器官移植術(shù)、呼吸道感染等免疫力低下患者,尤其在囊性纖維化(cystic fibrosis,CF)患者中,該菌感染是主要的致死原因[7]。銅綠假單胞菌的特定生活方式使其對抗生素的抗性增加,給臨床治療帶來很大困難。我院收集的數(shù)據(jù)顯示,2016年9月至2019年8月銅綠假單胞菌耐碳青霉烯類抗生素的比率明顯升高(表1)。T6SS在銅綠假單胞菌的致病過程中扮演了重要的角色,它通過復(fù)雜的類似噬菌體尾部結(jié)構(gòu)的分泌裝置分泌效應(yīng)蛋白并將其直接注入宿主細(xì)胞內(nèi)[8],引起宿主細(xì)胞相應(yīng)的病理性變化。鑒于T6SS在銅綠假單胞菌中的重要性,目前越來越多的科研人員致力于其致病性的研究,同時(shí)針對該系統(tǒng)的小分子抑制劑及疫苗的研發(fā)也為控制和預(yù)防銅綠假單胞菌的感染提供了新的治療手段。本文結(jié)合最近幾年銅綠假單胞菌中T6SS的最新研究成果及我們課題組的研究工作,闡述了T6SS的結(jié)構(gòu)、調(diào)控及其參與鐵離子的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。

1 T6SS的結(jié)構(gòu)、裝配及分泌

1.1 T6SS的結(jié)構(gòu)

研究指出,在所有測序的革蘭氏陰性菌中,將近25%的細(xì)菌具有編碼T6SS的基因簇,其中就包括銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、不動桿菌屬(Acinetobacter)等[9]。T6SS的基因簇在不同物種間的組成成分略有差異,但其13個(gè)保守基因的編碼產(chǎn)物(TssA～TssM)是T6SS發(fā)揮正常功能所必需的,因此不同病原菌的T6SS在電子顯微鏡下具有相似的結(jié)構(gòu),它是一種復(fù)雜的收縮注射系統(tǒng)[10～13]。根據(jù)功能的不同,銅綠假單胞菌中T6SS的結(jié)構(gòu)蛋白大致可以分為三類。第一類是與跨膜結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白質(zhì),包括TssL、TssM及脂蛋白TssJ等,這些蛋白質(zhì)相互作用形成橫跨整個(gè)細(xì)胞膜的復(fù)合體；第二類是與類噬菌體尾部結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白質(zhì),它們根據(jù)功能的不同又可以分為3組:1)噬菌體注射器樣結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白質(zhì)。該組蛋白質(zhì)由溶血素共調(diào)節(jié)蛋白(hemolysin co-regulated protein,Hcp)和纈氨酸-甘氨酸重復(fù)蛋白(valine glycine repeat protein G,VgrG)組成,其中Hcp形成尾管結(jié)構(gòu)(類似T4噬菌體尾管蛋白質(zhì)gp19[14]),VgrG形成細(xì)胞穿刺的尖端(與T4噬菌體尾部尖端蛋白質(zhì)類似)。此外,Hcp-VgrG結(jié)構(gòu)的末端還有一個(gè)類似針頭的脯氨酸-丙氨酸-丙氨酸-精氨酸重復(fù)蛋白(proline-alanine-alanine-arginine,PAAR),使注射器樣的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定、尖銳[15]；2)噬菌體尾鞘樣結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白質(zhì)。該組蛋白質(zhì)由TssB/TssC亞基組成,亞基與噬菌體蛋白質(zhì)gp18高度相似,其在Hcp管的周圍形成管鞘,通過管鞘的收縮將“注射器樣結(jié)構(gòu)”射至靶細(xì)胞表面,從而穿刺靶細(xì)胞的細(xì)胞膜,將效應(yīng)蛋白注入胞內(nèi)[16]；3)噬菌體基板樣結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白質(zhì)。該組蛋白質(zhì)主要包括 TssA、TssE、TssF、TssG 和 TssK 等,形成與噬菌體gp25類似的基板樣結(jié)構(gòu)[17]；第三類是裝置中負(fù)責(zé)能量供應(yīng)的蛋白質(zhì),主要是ClpV(caseinolytic protease V)。ClpV是一種具有腺苷三磷酸酶(adenosine triphosphatase,ATPase)活性的保守成分,對Hcp、VgrG及其同源蛋白底物的分泌至關(guān)重要[18]。T6SS的結(jié)構(gòu)模型[19]詳見圖1。

表1 2016—2019年我院銅綠假單胞菌的耐藥率Table 1 The drug resistance rates of P.aeruginosa in our hospital from 2016 to 2019

1.2 T6SS的裝配及分泌

T6SS是一種特殊的大分子蛋白質(zhì)輸出裝置,目前一些研究認(rèn)為T6SS中噬菌體樣的注射裝置可能是在一些外界因子(如競爭性菌、鐵離子濃度、營養(yǎng)物質(zhì)等)的刺激下被激活的,這樣注射裝置是如何裝配的就顯得尤為重要[20]。有研究認(rèn)為,T6SS注射裝置被激活時(shí),首先,TssM、TssL和TssJ形成跨膜結(jié)構(gòu),為接下來基板復(fù)合體的組裝提供平臺；其次,TssA、TssE、TssF、TssG 和 TssK 形成基座部分,VgrG、PAAR及效應(yīng)蛋白被招募到基座復(fù)合物上,從而穩(wěn)定整個(gè)復(fù)合物；隨后,Hcp蛋白以VgrG三聚體為聚合起點(diǎn)形成跨膜的尾管結(jié)構(gòu)；最后,TssB-TssC隨著Hcp管的延伸而聚合到其外圍,從而完成整個(gè)裝配過程[19]。整個(gè)過程主要由ClpV水解ATP提供能量。相關(guān)研究報(bào)道,銅綠假單胞菌中T6SS的分泌具有與噬菌體注射遺傳物質(zhì)類似的方式[9]。利用ClpV水解ATP釋放的能量,噬菌體樣尾鞘結(jié)構(gòu)收縮,引起Hcp管向細(xì)胞外延伸,使VgrG-PAAR“針頭”樣結(jié)構(gòu)刺穿靶細(xì)胞[21],此時(shí)效應(yīng)蛋白通過與Hcp、VgrG或PAAR特異性結(jié)合而被輸送到靶細(xì)胞內(nèi)[22]。當(dāng)一輪分泌過程完成后,ClpV蛋白將部分尾鞘和Hcp管解聚,剩余未被注射的Hcp管狀物和基座復(fù)合物則在下一輪注射過程中被持續(xù)利用[19,23]。

圖1 T6SS的結(jié)構(gòu)和機(jī)理示意圖(改編自參考文獻(xiàn)[19])TssJLM形成跨膜結(jié)構(gòu)；TssAEFGK形成基座；Hcp形成尾管結(jié)構(gòu)；TssBC在Hcp管周圍形成管鞘；VgrG-PAAR形成穿刺尖端；ClpV水解ATP為整個(gè)分泌裝置供能。Fig.1 Schematic representation of the structure and mechanism of the T6SS(adapted from reference[19])TssJLM forms a transmembrane structure,TssAEFGK forms a base,Hcp forms a tail tube structure,TssBC forms a sheath around Hcp,VgrG-PAAR forms a puncture tip,and ClpV hydrolyzes ATP to power for the entire secretion system.

2 銅綠假單胞菌T6SS的調(diào)控

在銅綠假單胞菌中T6SS受到很多因素的調(diào)控,包括群體感應(yīng)系統(tǒng)(quorum sensing system,QSS)、鐵吸收調(diào)節(jié)蛋白(ferric uptake regulator,Fur)、RsmA(regulator of secondary metabolites A)等。

2.1 QS系統(tǒng)對T6SS的調(diào)控

銅綠假單胞菌在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)受到QS系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)至少包括4種子系統(tǒng):外源信號?；呓z氨酸內(nèi)酯(acylhomoserine lactone,AHL)依賴的las系統(tǒng)和rhl系統(tǒng)；烷基喹諾酮[2-alkyl-4(1H)-quinolone,AHQ]信號依賴的pqs系統(tǒng)；非核糖體肽合成酶基因簇amb－BCDE 編碼的 iqs系統(tǒng)[11,24～25]。QS 系統(tǒng)的 las系統(tǒng)、rhl系統(tǒng)和pqs系統(tǒng)共同參與調(diào)控銅綠假單胞菌毒力因子的釋放、生活方式的適應(yīng)性改變等。已有研究表明QS系統(tǒng)能夠調(diào)控銅綠假單胞菌中T6SS相關(guān)基因的表達(dá),但對3種不同T6SS基因簇的調(diào)控存在一定的差異。Lesic等[26]研究發(fā)現(xiàn),H1-T6SS的基因表達(dá)受pqs系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子MvfR(multiple virulence factor regulator)和las系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子LasR(transcriptional regulator)的負(fù)調(diào)控；而H2-T6SS和H3-T6SS的基因表達(dá)受到LasR和MvfR的正向調(diào)控。此外,部分H3-T6SS的表達(dá)需要MvfR調(diào)節(jié)子的關(guān)鍵成分PqsE(Pseudomonas quinolone signal E)參與,而H2-T6SS的表達(dá)不需要 PqsE[27～28]。

2.2 Fur對T6SS的調(diào)控

鐵作為必需的微量營養(yǎng)素,對細(xì)菌的生長是必不可少的[29],但當(dāng)胞內(nèi)的鐵過量時(shí),Fe2+在過氧化氫存在的條件下產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS),破壞細(xì)胞的基本成分,而細(xì)菌可通過Fur調(diào)控菌體內(nèi)鐵離子代謝的平衡,因此Fur對細(xì)菌生長和防止鐵毒性起重要作用[30]。除了在調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)中的作用外,Fur還參與細(xì)菌許多毒力基因的表達(dá)。銅綠假單胞菌H2-T6SS啟動子區(qū)域存在兩個(gè)Fur基因盒,當(dāng)外界環(huán)境中有鐵存在時(shí),Fur阻止RNA聚合酶與-10區(qū)結(jié)合,從而抑制H2-T6SS相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄；當(dāng)鐵受限制時(shí),H2-T6SS基因受Fur的調(diào)控并表達(dá),最終增強(qiáng)其對靶細(xì)胞的致病性[31]。

2.3 RsmA對T6SS的調(diào)控

雙組分系統(tǒng)(two-component system,TCS)信號傳導(dǎo)途徑是細(xì)菌和古細(xì)菌中的主要信號傳導(dǎo)機(jī)制,它們利用TCS途徑來監(jiān)測關(guān)鍵的外部和內(nèi)部刺激(包括營養(yǎng)物水平、離子和氣體濃度、溫度、氧化還原狀態(tài)和細(xì)胞密度等),并將這些信號轉(zhuǎn)化為適應(yīng)性反應(yīng)。T6SS分泌系統(tǒng)的分泌及相關(guān)毒力基因的表達(dá)由一對通過GacSA-RsmY/Z-RsmA級聯(lián)通路作用的雙組分傳感器激酶RetS(regulator of exopolysaccharide and typeⅢ secretion)和 LadS(lost adherence sensor)協(xié)同調(diào)節(jié)[32],RsmA作為此通路中的關(guān)鍵調(diào)控因子對銅綠假單胞菌的T6SS分泌及生物膜的形成具有負(fù)向調(diào)控作用,并與銅綠假單胞菌急性感染和慢性感染持續(xù)性相關(guān)的多種毒力表型密切相關(guān)[33～34]。在這一調(diào)控過程中,LadS引起通路的關(guān)鍵調(diào)控因子——游離的RsmA濃度降低,RetS則發(fā)揮截然相反的調(diào)控作用。因此,RetS和LadS能夠分別通過GacSA-RsmY/Z對RsmA進(jìn)行間接調(diào)控,進(jìn)而影響銅綠假單胞菌T6SS的分泌。

3 T6SS參與鐵離子的轉(zhuǎn)運(yùn)

鐵作為酶、調(diào)節(jié)蛋白和參與新陳代謝信號傳導(dǎo)的蛋白質(zhì)復(fù)合物的組分,在許多細(xì)菌的生命活動中發(fā)揮重要作用。金屬離子可以通過被動擴(kuò)散穿過細(xì)胞膜,但是革蘭氏陰性菌必須通過主動運(yùn)輸系統(tǒng)將稀有的金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi),以滿足細(xì)胞的需求[35～36],T6SS在其中就扮演了重要的角色。當(dāng)受到外界刺激時(shí),細(xì)菌通過T6SS分泌效應(yīng)蛋白到細(xì)胞外,協(xié)助胞外的金屬離子通過細(xì)胞外膜蛋白進(jìn)入周質(zhì),再進(jìn)一步通過內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)至胞內(nèi)[27,37～38]。

Shen等[27]在缺鐵培養(yǎng)基中篩選生長缺陷的銅綠假單胞菌突變株時(shí)發(fā)現(xiàn),H3-T6SS附近的PA2374(Pseudomonas aeruginosa 2374)基因(也稱作tseF)與已知的鐵獲取系統(tǒng)[39～41]具有協(xié)同作用。然而TseF作為T6SS的底物,研究中并沒有檢測到其與鐵離子之間的相互作用。那么,銅綠假單胞菌是否分泌了其他分子來參與鐵離子的吸收？該研究團(tuán)隊(duì)通過蛋白質(zhì)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)(pull down實(shí)驗(yàn))發(fā)現(xiàn),谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GST)-TseF蛋白可以與銅綠假單胞菌培養(yǎng)上清液中的某些分子相互作用,而且液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)分析顯示該分子為PQS(Pseudomonas quinolone signal)；敲除產(chǎn)生PQS信號相關(guān)的基因pqsA和pqsH后,突變體的上清液與GSTTseF蛋白不再有相互作用,證明PQS與TseF確實(shí)有相互作用；在進(jìn)一步的生長實(shí)驗(yàn)中,tseF的缺失使Fe3+結(jié)合的PQS(PQS-Fe3+)不能提供銅綠假單胞菌生長所需的鐵,而Fe3+的加入使PQS與TseF有更強(qiáng)的相互作用,說明tseF促進(jìn)銅綠假單胞菌從PQS-Fe3+中吸收鐵。銅綠假單胞菌的外膜囊泡(outer membrane vesicle,OMV)含有大量PQS分子[42],研究顯示,從△tseF純化出的OMV蛋白中存在TseF,但△tseF△pqsH不表達(dá)TseF,這表明TseF與OMV的關(guān)聯(lián)是以PQS依賴的方式發(fā)生的[27]。這些結(jié)果表明,分泌的TseF被嵌入OMV中,再與鐵結(jié)合的PQS相互作用,將金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面的受體上。

鐵離子是如何通過復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞的？銅綠假單胞菌表面是否存在受體蛋白可以傳遞鐵離子？相關(guān)研究采用pull down實(shí)驗(yàn)、質(zhì)譜分析確定TseF與鐵載體(Fe3+-pyochelin)受體同源性的FptA[43]和毒力有關(guān)的孔蛋白OprF均有相互作用[27]。為了驗(yàn)證TseF的結(jié)合靶點(diǎn),Shen等[27]創(chuàng)建了突變體菌株P(guān)A△3Fe△tseF△fptA△oprF,然而該突變體只有當(dāng)TseF和其中一個(gè)受體蛋白同時(shí)表達(dá)時(shí),才能利用PQS-Fe3+作為唯一的鐵源促進(jìn)生長。

綜上所述可知,TseF作為T6SS的底物,通過與PQS-Fe3+作用直接結(jié)合OMV,隨后與受體蛋白FptA和孔蛋白OprF相互作用,促進(jìn)Fe3+向細(xì)胞內(nèi)輸送[27]。圖2簡單整理了銅綠假單胞菌中T6SS參與鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制。

目前,銅綠假單胞菌中關(guān)于T6SS參與其他金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)的研究還沒有被報(bào)道,但是已有研究發(fā)現(xiàn)在其他細(xì)菌中也存在類似的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。在假結(jié)核耶爾森菌(Yersinia pseudotuberculosis)中,人們發(fā)現(xiàn)存在與鐵載體類似的螯合化合物來轉(zhuǎn)運(yùn)Zn2+,這一發(fā)現(xiàn)揭示了T6SS通過競爭基本物質(zhì)和減少ROS來增強(qiáng)細(xì)菌適應(yīng)性方面的功能[37]；在伯克霍爾德菌(Burkholderia thailandensis)中,Shen等[37]提出了由TonB依賴性外膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MnoT和T6SS效應(yīng)子TseM介導(dǎo)的Mn2+跨外膜主動轉(zhuǎn)運(yùn)模型,并發(fā)現(xiàn)T6SS對伯克霍爾德菌在氧化應(yīng)激條件下的生存具有重要意義[38],這為我們進(jìn)一步研究銅綠假單胞菌提供了參考。我們課題組前期利用蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)對H2-T6SS的分泌組進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示H2-T6SS分泌103種蛋白質(zhì),其中包括Cu2+結(jié)合蛋白Azu。為了探究H2-T6SS與Cu2+之間的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制,我們通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了H2-T6SS和Azu的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子CueR,并揭示了在CueR的調(diào)控下H2-T6SS通過分泌效應(yīng)因子Azu參與對Cu2+的吸收。那么Azu是如何將Cu2+轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)的呢？銅綠假單胞菌的外膜上也存在多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,其是否也跟伯克霍爾德菌一樣,存在一種TonB依賴性外膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,將Cu2+轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)？相關(guān)問題還需要進(jìn)一步研究。

圖2 銅綠假單胞菌中T6SS參與鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)的示意圖(改編自參考文獻(xiàn)[27])TseF通過T6SS分泌至胞外,與含有PQS-Fe3+的OMV結(jié)合,隨后細(xì)胞表面受體FptA或OprF對TseF進(jìn)行識別,進(jìn)而促進(jìn)鐵向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。Fig.2 Schematic representation of T6SS involved in iron ion transport in P.aeruginosa(adapted from reference[27])TseF is exported by T6SS and binds to OMV containing PQS-Fe3+.Recognition of TseF by the cell surface receptor FptA or O-prF would facilitate the transport of iron into the cell.

4 小結(jié)與討論

銅綠假單胞菌是一種能引起多部位急慢性感染且難以用抗生素控制的機(jī)會致病菌,擁有多種致病機(jī)制和耐藥機(jī)制。大量研究表明,銅綠假單胞菌通過T6SS將毒力因子精準(zhǔn)輸送至宿主細(xì)胞是其致病的關(guān)鍵[16～17,19]。本文重點(diǎn)闡述了T6SS的結(jié)構(gòu)組成、調(diào)控及其參與鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制,總結(jié)了T6SS特殊的“注射器”結(jié)構(gòu)不但可以分泌效應(yīng)蛋白直接殺死競爭細(xì)胞,還可以通過轉(zhuǎn)運(yùn)金屬離子競爭必需營養(yǎng)物質(zhì)[18,22,44],揭示了T6SS在銅綠假單胞菌致病力中的重要作用。

近幾年,銅綠假單胞菌的T6SS已成為微生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),其結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能研究已經(jīng)取得了很大進(jìn)展,但是仍然有許多亟待解決的問題。例如:銅綠假單胞菌中T6SS識別靶細(xì)胞的分子機(jī)制是什么？T6SS是否可以通過效應(yīng)物轉(zhuǎn)運(yùn)其他的金屬離子或分子？新的一項(xiàng)研究表明,在銅綠假單胞菌中,T6SS的效應(yīng)物TplE通過與其同源免疫蛋白TplEi相互作用而防止自身中毒,當(dāng)在體外使用一種小分子化合物或肽作為TplETplEi的抑制劑時(shí),可誘導(dǎo)銅綠假單胞菌中毒和自溶[45],該發(fā)現(xiàn)為新型抗生素的研發(fā)提供了新方法?；诖?我們可以試想在T6SS通過效應(yīng)物轉(zhuǎn)運(yùn)金屬離子的過程中是否也存在類似的作用方式。研究者可以從T6SS效應(yīng)蛋白的結(jié)構(gòu)入手,結(jié)合其活性位點(diǎn),尋找與金屬離子之間的關(guān)系,探尋其中隱藏的機(jī)制。另外,隨著研究的不斷深入,銅綠假單胞菌T6SS參與其他金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)方面的研究也將取得突破性的進(jìn)展,例如:其如何通過轉(zhuǎn)運(yùn)Cu2+、Mn2+等來適應(yīng)進(jìn)化過程中的復(fù)雜環(huán)境。這能為我們理解T6SS的不同功能及金屬離子對銅綠假單胞菌的作用提供新的思路。