丁樹榮，李婷婷*，陸冰洋，劉華棟，唐娟，王彩先

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所太原 030032）

2020 年4 月太谷縣某雞場發(fā)生疫病，30 日齡雛雞陸續(xù)發(fā)病，出現(xiàn)精神沉郁、采食量下降、并有零星死亡，場主帶3 只剛死亡雛雞和3 只發(fā)病活雛雞前來本實驗室進行診斷。經(jīng)病理剖檢和實驗室診斷，確診為傳染性法氏囊病繼發(fā)感染大腸桿菌。經(jīng)對癥治療后，病情很快得到控制。

1 臨床癥狀

病雞精神沉郁，有的閉眼縮脖、羽毛蓬亂，有的臥地不起、反應(yīng)遲鈍；體溫升高，采食量和飲水量均下降，排白色水樣稀便、肛門周圍羽毛被糞便污染，病程6d 左右，每天零星死亡3～5 只。

2 病理變化

對病雞和病死雞進行病理剖檢可見，心臟和肝臟被白色纖維素性沉淀物包裹，呈現(xiàn)“包心包肝”現(xiàn)象；氣囊渾濁；肝臟腫大，呈土黃色，質(zhì)脆易碎；腺胃與肌胃交界處出血；十二指腸、小腸黏膜水腫、出血；盲腸扁桃體腫大、出血；法氏囊水腫，體積增大約2～3倍，有出血點和出血斑，法氏囊切開，可見白色滲出物。其他臟器未見明顯病變。

3 實驗室檢測

3.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

無菌采集病雞心血及肝臟組織，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板。經(jīng)37℃恒溫培養(yǎng)24h，可見瓊脂上形成一種圓形凸起、表面光滑濕潤、邊緣整齊的灰白色菌落。挑取單個菌落，劃線接種于麥康凱瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂，穿刺接種于三糖鐵斜面，37℃培養(yǎng)24h。結(jié)果如圖1、2、3。

培養(yǎng)結(jié)果可見，在麥康凱瓊脂上形成紅色圓形菌落，伊紅美藍(lán)瓊脂上形成黑色帶金屬光澤的菌落，三糖鐵斜面產(chǎn)氣變色。

挑取麥康凱瓊脂上單個菌落涂片，經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢，結(jié)果如圖4，可見兩端鈍圓、呈紅色的革蘭氏陰性短桿菌。

圖1 麥康凱瓊脂

圖2 伊紅美藍(lán)瓊脂

圖3 三糖鐵斜面

圖4 革蘭氏染色結(jié)果

3.2 生化鑒定

將純化培養(yǎng)的細(xì)菌接種于營養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)24h 后，進行常規(guī)生化試驗鑒定，結(jié)果可見表1，根據(jù)生化試驗結(jié)果，判定分離菌為大腸桿菌。

表1 生化鑒定結(jié)果

3.2 細(xì)菌藥敏試驗

采用K-B 試紙擴散法[1]，以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株ATCC25922 為參照，選用22 種臨床常用藥物進行敏感性試驗。使用滅菌棉拭子蘸取純培養(yǎng)的大腸桿菌菌液，均勻涂布在營養(yǎng)瓊脂平板上，將鑷子于酒精燈灼燒后，取藥敏紙片等距離貼于營養(yǎng)瓊脂表面。37℃培養(yǎng)24h 后觀察結(jié)果。結(jié)果參考CLSI 標(biāo)準(zhǔn)做出判定[2]，結(jié)果見表2。

由表2 結(jié)果可知，大腸桿菌分離株對氧氟沙星、丁胺卡那、環(huán)丙沙星高度敏感，對磷霉素、培氟沙星、頭孢噻肟、恩諾沙星、慶大霉素中度敏感，其他藥物均耐藥。

表2 藥敏試驗結(jié)果

3.3 IBDV RT-PCR 鑒定

根據(jù)GeneBank 中發(fā)表的IBDV 基因序列設(shè)計引物：IBDVF：5'-CGTTTCCCTCWCAATCCACG-3'，IBDVR：5'-CTCATGTCTTCATGAGACAG-3'，擴增其保守序列，目的片段為831bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司進行合成。

3.3.1 病毒RNA 的提取采集送檢發(fā)病雞的肝臟、脾臟、肺臟和法氏囊器官各1g，剪碎混勻后稱取0.05g 混合物，加入1mL 生理鹽水進行研磨勻漿。8000rpm 離心2min 后，取上清液100μL 于新的離心管中，按照RNA 提取試劑盒使用說明書，經(jīng)過裂解、吸附、洗滌、洗脫后得到模板RNA 備用。

3.3.2 RT-PCR 擴增及電泳 參照PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒說明書對病毒RNA 進行反轉(zhuǎn)錄。PCR 反應(yīng)按照10×Dream Taq Buffer 5μL；IBDVF（10 μmol/L）2μL；IBDVR（10μmol/L）2μL；dNTP（10μmol/L）1μL；ddH2O 28.5μL；Template 8μL；Taq 酶（5U/μL）0.5μL；MgCl23μL；混合均勻成50μL 反應(yīng)體系。PCR擴增程序為：94℃預(yù)變性10min，94℃變性30s，56℃退火60s，72℃延伸60s，循環(huán)共35 次；最后72℃延伸10min。PCR 擴增產(chǎn)物在110V 電壓下使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖5。

由圖5 可見，被檢測樣品擴增出831bp 的特異性條帶，初步判定從病料中分離的病毒為IBDV。

圖5 新城疫RT-PCR 檢測結(jié)果

4 結(jié)果與診斷

根據(jù)病雞臨床癥狀、病理剖檢變化及實驗室檢測結(jié)果，病雞可診斷為傳染性法氏囊病繼發(fā)大腸桿菌感染。

5 治療

淘汰并無害化處理發(fā)病雞。雞群緊急注射接種傳染性法氏囊高免卵黃抗體1mL/羽。根據(jù)藥敏試驗結(jié)果選用高敏藥物丁胺卡那飲水治療大腸桿菌感染，連用5～7d。加強養(yǎng)殖場飼養(yǎng)管理，做好日常消毒和清潔工作。第3d 開始無新增發(fā)病和死亡病雞，經(jīng)過5d 治療，雞群基本痊愈。

6 討論

傳染性法氏囊病（Infectious bursal disease，IBD）是由傳染性法氏囊病病毒（lnfectious bursal disease virus，IBDV）引起的一種急性、高度接觸性傳染病[3]，該病主要侵害3～7 周齡雛雞，以損傷雞的免疫器官法氏囊中的淋巴細(xì)胞為特征，導(dǎo)致免疫抑制，降低病雞對疫苗的免疫效力，增加了病雞對其它細(xì)菌性和病毒性疾病的易感性，臨床上常伴發(fā)細(xì)菌性疾病的混合感染[4]，且近年來山西分離到IBDV 超強毒株[5]，使雞的死亡、淘汰率增加，生產(chǎn)性能下降，給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大危害和損失。目前針對IBD 的治療尚無特效藥物，疫苗接種仍是主要防治手段。隨著養(yǎng)殖業(yè)和免疫技術(shù)的發(fā)展，大型現(xiàn)代化養(yǎng)殖場雞傳染性法氏囊病免疫良好，但仍有部分地區(qū)的散養(yǎng)戶未嚴(yán)格執(zhí)行免疫程序和雞舍消毒措施，導(dǎo)致免疫失敗甚至IBD 的流行和傳染。本研究中該雞場在已免疫IBD 疫苗后仍發(fā)病，可能與雛雞母源抗體參差不齊、疫苗運輸及使用不當(dāng)?shù)纫蛩赜嘘P(guān)[5,6]。

大腸桿菌是生產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的一種條件性致病菌，雞群在受到IBD 等免疫抑制疾病感染時，免疫力下降，加之較差的雞舍飼養(yǎng)環(huán)境都增加了大腸桿菌等致病菌的感染率。臨床上分離到的大腸桿菌耐藥性強，嚴(yán)重影響了藥物的選用和治療，因此在雞群發(fā)病初期就應(yīng)及時通過實驗室診斷及藥敏試驗選擇合理高敏的抗生素藥物進行治療。

養(yǎng)殖場和養(yǎng)殖戶要選擇正確的疫苗，嚴(yán)格執(zhí)行合理的免疫程序和免疫監(jiān)測制度，雞群發(fā)生本病后，病雞應(yīng)及時注射雞傳染性法氏囊病高免血清或高免卵黃抗體進行治療；定期消毒，每周輪流使用兩種消毒劑，對養(yǎng)殖環(huán)境和養(yǎng)殖工具進行全面徹底的噴灑消毒2～3 次，防止疫情擴散和蔓延；保持雞舍通風(fēng)，由于山西地區(qū)春季晝夜溫差較大，要協(xié)調(diào)好通風(fēng)和保溫工作。█