劉丹妮，張珂，陳曉祥，楊璐，潘馨慧，王航宇，王金輝,3*

(1 石河子大學(xué)藥學(xué)院/新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室，新疆 石河子，832002；2 新疆林業(yè)科學(xué)院/新疆林業(yè)資源與利用國家林草局重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830052；3 深圳弘?yún)R生物醫(yī)藥有限公司，廣東 深圳 518000)

薔薇紅景天(RhodiolaroseaL.)是一種在歐洲和亞洲廣泛應(yīng)用的藥用植物，其在中國主要分布在東北、西北和西南，廣泛生長于新疆地區(qū)，其具有抗腦缺血、抗氧化、抗輻射、調(diào)節(jié)免疫和抗疲勞等功效[1-4]。薔薇紅景天中主要含以下幾類化學(xué)成分：苯丙烯醇苷類(絡(luò)塞維，絡(luò)塞琳)，苯乙醇苷類(紅景天苷，酪醇)，黃酮苷類(草質(zhì)素甙，山柰酚-7-O-α-L-吡喃鼠李糖甙)單萜類(絡(luò)塞定)，其中紅景天苷、酪醇以及絡(luò)塞維是薔薇紅景天中主要的活性成分，主要特征性成分是絡(luò)塞維、絡(luò)塞琳和絡(luò)塞定等化合物[5](圖1)。研究發(fā)現(xiàn)，薔薇紅景天具有雙向調(diào)節(jié)和延緩衰老的藥理活性，這種的活性不僅與紅景天苷相關(guān)更與其特殊成分絡(luò)塞維，絡(luò)塞琳等苯丙素苷類成分有關(guān)。絡(luò)塞維是某些品種紅景天中重要活性成分，它在薔薇紅景天中含量較高，是其特有指標成分之一，具有良好的抗炎，和抗肺纖維化的作用[6-7]。絡(luò)塞琳和絡(luò)塞定可以有效的促進神經(jīng)興奮抗抑郁癥[8-9]、益智[10-11]、抗癌[12]等作用。

圖1 絡(luò)塞維、絡(luò)塞琳和絡(luò)塞定的化學(xué)結(jié)構(gòu)

目前，在《中國藥典》收錄的紅景天藥材為大花紅景天(RhodiolacrenulataHk.F.et al.,Thoms)[13]，主要對紅景天苷進行質(zhì)量監(jiān)控，而對絡(luò)塞維、絡(luò)塞琳和絡(luò)塞定的質(zhì)量控制較為缺少。有部分研究集中于對薔薇紅景天有效成分的分離純化，其活性成分和質(zhì)量控制的也主要集中在紅景天苷，而對其特有成分絡(luò)塞維，絡(luò)塞琳和絡(luò)塞定的研究較少，其含量測定也多采用HPLC，檢測時間較長，分離度低[14-15]。

本研究中建立了UPLC方法同時測定薔薇紅景天中絡(luò)塞維、絡(luò)塞琳和絡(luò)塞定的含量，多種成分的含量測定可以全面反應(yīng)藥材質(zhì)量，提高其抗炎、抗肺纖維化和抗抑郁等藥理作用。該方法取樣量少，簡單快速，靈敏度和分離度高，為有效的控制薔薇紅景天的質(zhì)量和改善藥理作用提供更高效的方法，為其制劑的研發(fā)和臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀(Waters ACQUITY UPLC，美國Water公司)，Empower 2.0色譜工作站，F(xiàn)W-100型高速萬能粉碎機(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)，BSA224S型萬分之一電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，SY-360型超聲波清洗儀(上海寧商超聲儀器有限公司)，TGL-16G型離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)，SZ-93 A自動雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)。

薔薇紅景天，由石河子大學(xué)藥學(xué)院譚勇教授鑒定為紅景天屬薔薇紅景天干燥的根，絡(luò)塞維(實驗室自制，純度≥98%)，絡(luò)塞琳(實驗室自制，純度≥98%)，絡(luò)塞定(實驗室自制，純度≥98%)，甲醇、乙腈(色譜級，DUKSAN化學(xué)試劑公司，韓國)，分析級磷酸(武漢化學(xué)試劑廠)，水(實驗室自制)。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)柱，流動相A：甲醇-乙腈(1∶1)，流動相B：0.1%的磷酸水溶液，梯度洗脫條件見表1，流速為0.2 mL · min-1，柱溫：30 ℃，檢測波長為210 nm。

表1 流動相梯度洗脫條件

1.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取對照品絡(luò)塞維、絡(luò)塞琳和絡(luò)塞定各適量，分別置于10 mL容量瓶中，使用色譜級甲醇進行溶解，并定容至刻度線，搖勻，即得到濃度分別為1.000、0.940和5.500 mg · mL-1的絡(luò)塞維、絡(luò)塞琳和絡(luò)塞定對照品儲備溶液。

精密吸取1.000、0.940和5.500 mg · mL-1的絡(luò)塞維、絡(luò)塞琳和絡(luò)塞定對照品儲備溶液適量，分別置于2 mL容量瓶中，使用色譜級甲醇進行定容，搖勻，即可得到每1 mL含絡(luò)塞維 150.00 μg、絡(luò)塞琳 47.00 μg和絡(luò)塞定 550.00 μg的混合對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備

精密稱取薔薇紅景天粉末約1.0 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入甲醇25 mL，混勻后，進行重量的稱定，在室溫條件下超聲30 min，溶液恢復(fù)到室溫，再次重量稱定，使用甲醇補足重量，混勻后，于4 000 r · min-1條件下離心10 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，濾液即為薔薇紅景天供試品溶液，取1 μL供試品溶液注入超高效液相色譜儀中進行檢測。

1.2.4 方法學(xué)考察

1.2.4.1 專屬性考察

精密吸取甲醇溶劑、混合溶液和薔薇紅景天供試品溶液在“1.2.1”色譜條件下進樣分析，進樣量1 μL。

1.2.4.2 線性關(guān)系考察

分別精密吸取混合對照品溶液0.1、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2 μL，在“1.2.1”色譜條件下進行色譜分析，以對照品的濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，計算回歸方程。

1.2.4.3 精密度試驗

取同一混合對照品溶液重復(fù)進樣6次，進樣量1 μL，以“1.2.1”色譜條件進行色譜分析。計算絡(luò)塞維、絡(luò)塞琳和絡(luò)塞定峰面積的RSD值。

1.2.4.4 穩(wěn)定性試驗

室溫條件下，同一份供試品溶液分別取1 μL于0、1、2、4、6、8、12 h在“1.2.1”色譜條件下進行色譜分析，計算絡(luò)塞維、絡(luò)塞琳和絡(luò)塞定在12 h的峰面積的RSD值。

1.2.4.5 重復(fù)性試驗

精密稱取同一批號薔薇紅景天供試品6份，按照“1.2.3”方法制備供試品溶液，取1 μL供試品溶液在“1.2.1”色譜條件下進樣分析，檢測絡(luò)塞維、絡(luò)塞琳和絡(luò)塞定的含量并計算RSD值。

1.2.4.6 加樣回收率試驗

精密稱取已測含量的同一批次薔薇紅景天供試品6份，每份質(zhì)量約1 g，分別精密加入等量的混合對照品溶液，按照“1.2.3”的方法制備供試品溶液，在“1.2.1”色譜條件下進樣1 μL進行分析，檢測供試品的含量，并計算絡(luò)塞維、絡(luò)塞琳和絡(luò)塞定平均回收率和RSD值。

1.2.4.7 樣品測定

精密稱取8批新疆省不同批次的薔薇紅景天，按照“1.2.3”的方法制備供試品溶液，在“1.2.1”色譜條件下進樣1 μL進行分析，分別測定樣品中絡(luò)塞維、絡(luò)塞琳和絡(luò)塞定的含量。

2 結(jié)果

2.1 專屬性試驗

供試品和對照品具有相同保留時間的色譜峰，空白溶劑甲醇在保留時間處未出現(xiàn)色譜峰，說明溶劑無干擾。色譜圖見圖2。

a：空白溶劑;b：絡(luò)塞琳對照品;c：絡(luò)塞維對照品;d：絡(luò)塞定對照品;e：對照品混合溶液;f：薔薇紅景天供試品；1：絡(luò)塞琳;2：絡(luò)塞維;3：絡(luò)塞定。

2.2 標準曲線的建立

以對照品的濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，建立各成分標準曲線，結(jié)果顯示絡(luò)塞維、絡(luò)塞琳和絡(luò)塞定在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程及線性范圍如表2所示。

表2 絡(luò)塞維、絡(luò)塞琳和絡(luò)塞定的線性回歸方程 n=7

2.3 精密度試驗

數(shù)據(jù)分析得到絡(luò)塞維、絡(luò)塞琳和絡(luò)塞定峰面積的RSD值分別為0.26%、0.30%和0.24%，結(jié)果顯示儀器具有良好的精密度，為檢測結(jié)果的準確性提供基礎(chǔ)。

2.4 穩(wěn)定性試驗

檢測得到絡(luò)塞維、絡(luò)塞琳和絡(luò)塞定的峰面積，數(shù)據(jù)分析顯示RSD值分別為1.30%、0.82%和0.39%，說明薔薇紅景天供試品在室溫條件下12 h具有良好的穩(wěn)定性。

2.5 重復(fù)性試驗

檢測得到絡(luò)塞維、絡(luò)塞琳和絡(luò)塞定的峰面積，數(shù)據(jù)分析顯示RSD值分別為1.49%、1.41%和1.26%，說明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.6 加樣回收率試驗

平行測定6份供試品，檢測得到絡(luò)塞維、絡(luò)塞琳和絡(luò)塞定平均回收率結(jié)果見表3，數(shù)據(jù)分析顯示RSD值分別為2.61%、2.86%和2.54%，加樣回收率符合標準范圍。

表3 絡(luò)塞維、絡(luò)塞琳和絡(luò)塞定的回收率測定結(jié)果 n=6

2.7 樣品測定

按照“1.2.4.7”的方法操作，將8個不同批次(S1-S8)的薔薇紅景天樣品測定結(jié)果通過2.2建立的線性回歸方程計算各樣品中絡(luò)塞維，絡(luò)塞琳和絡(luò)塞定的含量(表4)。

表4 樣品含量測定結(jié)果 n=3

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

本實驗中采用紫外-可見分光光度法，在190～400 nm波長范圍內(nèi)進行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)絡(luò)塞維、絡(luò)塞琳和絡(luò)塞定在210 nm處均有良好的峰形。210 nm作為檢測波長，能夠適用于各組分的檢測，同時響應(yīng)值均勻有效，結(jié)果具有代表性。

3.2 流動相的選擇

為實現(xiàn)供試品中絡(luò)塞維、絡(luò)塞琳和絡(luò)塞定有效的分離，并且不受溶劑和其他化學(xué)成分影響，對方法中流動相進行優(yōu)化，選用甲醇-水、甲醇-0.1%的磷酸溶液、乙腈-0.1%的磷酸溶液和甲醇-乙腈-0.1%的磷酸溶液分別作為流動相進行梯度洗脫。結(jié)果顯示，甲醇-乙腈-0.1%的磷酸溶液流動相系統(tǒng)具有良好的分離效果，故優(yōu)選該流動相系統(tǒng)對樣品進行梯度洗脫。

3.3 提取方法的選擇

本實驗考察了提取溶劑體積和提取時間對樣品提取率的影響，選用25、50 mL的甲醇溶劑對同一批薔薇紅景天藥材粉末進行超聲處理30 min，溶劑體積為25 mL時，可將樣品中絡(luò)塞維、絡(luò)塞琳和絡(luò)塞定3種成分完全提取，故選用25 mL甲醇溶劑進行樣品提取。對提取時間的考察，采用25 mL甲醇為提取溶劑，分別超聲提取20、 30、60 min，結(jié)果顯示，提取時間為30 min時上述3種成分可以完全被提取。因此，優(yōu)選25 mL甲醇，超聲提取30 min為提取條件。

3.4 含量測定

研究中考察了不同批次樣品中絡(luò)塞維、絡(luò)塞琳和絡(luò)塞定的含量，收集了新疆省8個不同批次的薔薇紅景天藥材，研究結(jié)果顯示，不同批次薔薇紅景天中絡(luò)塞維、絡(luò)塞琳和絡(luò)塞定的含量存在較大差異，含量范圍為0.01%～1.85%、0.04%～0.51%和0.11%～3.26%，這可能與藥材的生長年限、采集時間、氣候等有較大的相關(guān)性。絡(luò)塞維、絡(luò)塞琳和絡(luò)塞定是薔薇紅景天中特殊的有效活性成分，絡(luò)塞維不僅具有抗氧化、抗疲勞等基本功效還有良好的抗炎和治療肺纖維化的作用，絡(luò)塞琳和絡(luò)塞定也可以促進神經(jīng)興奮，具有抗抑郁和抗癌等功效。通過對其含量測定可明確藥物有效成分的含量，對薔薇紅景天以及相關(guān)制劑的安全性和有效性進行評價和控制，為改善藥物的藥理作用，提高藥用價值提供基礎(chǔ)。

綜上，本研究所建立的薔薇紅景天中絡(luò)塞維、絡(luò)塞琳和絡(luò)塞定的含量測定方法，具有靈敏度和精確度高，簡單快捷，準確性和重現(xiàn)性良好，穩(wěn)定性高，可應(yīng)用于薔薇紅景天的含量測定，優(yōu)化其質(zhì)量控制。該研究為薔薇紅景天的藥動學(xué)以及系統(tǒng)藥理學(xué)等研究奠定一定的基礎(chǔ)，同時為其制劑研發(fā)和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。