楊進(jìn)山，趙文超，侯鈺穎，李 萌，張琴林，王紹輝

(北京農(nóng)學(xué)院 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102206)

根結(jié)線蟲病是設(shè)施番茄生產(chǎn)中一種常見的土傳病害，受現(xiàn)實(shí)條件影響，防治難度高，這導(dǎo)致設(shè)施中番茄根結(jié)線蟲病日益加重，病害嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致絕收[1,2]。殺線劑是現(xiàn)階段防治根結(jié)線蟲的有效手段之一，主要包括克百威、滅線磷、涕滅威等，但是這些藥劑對(duì)人和環(huán)境造成一定傷害。隨著中國(guó)環(huán)保意識(shí)的不斷提高，法律規(guī)制度逐漸健全，綠色、安全的殺線劑越來越被人們關(guān)注和青睞。

近些年來，關(guān)于植物源的殺線劑正在受到人們的追捧，關(guān)于植物根系分泌物對(duì)抵抗根結(jié)線蟲報(bào)道也越來越多。楊國(guó)棟等的研究發(fā)現(xiàn)，抗性番茄的根系分泌物對(duì)RKN排斥作用，感性番茄根系分泌物則對(duì)對(duì)RKN吸引作用[3]。王艷艷等在研究黃瓜根系分泌物時(shí)發(fā)現(xiàn)高抗砧木的根系分泌物可以抑制線蟲的卵孵化[4]。Degenhardt等研究發(fā)現(xiàn)在玉米的根系分泌物中鑒定出(E)-β-石竹烯能夠吸引根結(jié)線蟲[5]。Hooks等研究發(fā)現(xiàn)菊科植物根系分泌物中的β-三聯(lián)噻吩可以排斥根結(jié)線蟲[6]。

經(jīng)過前期的根系分泌物代謝組分析，發(fā)現(xiàn)番茄株系根系分泌物中含有一種叫加巴噴丁的物質(zhì)，并且該化學(xué)物質(zhì)可通過商業(yè)手段購(gòu)得。不同濃度梯度的加巴噴丁溶液對(duì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲(J2)進(jìn)行趨化性和死亡率試驗(yàn)，體外篩選出對(duì)J2有抑制作用的濃度，以此來推測(cè)其運(yùn)用于生產(chǎn)的可行性。

1 材料與方法

1.1 植物材料

番茄品種為CM植株，番茄株系原始種子由中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所(北京)李傳友研究員惠贈(zèng)。

1.2 方 法

1.2.1 番茄幼苗的培養(yǎng)與管理 采用溫湯浸種法使種子萌發(fā)，待大部分種子“露白”后在穴盤中播種，育苗室中培養(yǎng)。育苗室的溫光設(shè)置為：晝夜溫度為26 ℃/18 ℃，光照期為16 h，暗期為8 h。根據(jù)番茄幼苗的生長(zhǎng)狀況，適時(shí)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)液，及時(shí)澆水通風(fēng)。

1.2.2 南方根結(jié)線蟲的繁殖與管理 根結(jié)線蟲為南方根結(jié)線蟲(Meloidogyneincongnita)，由農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自繁。將實(shí)驗(yàn)室易感番茄植株根系上淡黃色卵塊挑下后蒸餾水清洗干凈并消毒，放置在26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培育，24～72 h內(nèi)不斷觀察，挑選活力強(qiáng)的J2用于趨化性和致死率試驗(yàn)。

1.2.3 根系分泌物的收集及鑒定 采用浸根法收集番茄根系分泌物，用Herz等開發(fā)的方法收集根系分泌物[7]。將完整的根放在裝有150 mL蒸餾水并且用錫箔紙包裹的燒杯中。每4 h更換1次水，收集1次。為了進(jìn)一步分析，將滲出液過濾并濃縮至5 mL。待番茄植株長(zhǎng)至4葉1心時(shí)進(jìn)行分泌物收集試驗(yàn)，每處理6株重復(fù)。收集的分泌物經(jīng)過過濾、濃縮后采用LC-MS與GC-MS技術(shù)鑒定、分析根系分泌物的成分組成(北京凡星博奧生物技術(shù)有限公司測(cè)定)。

通過液相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)。色譜方法：色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18，2.1 mm×100 mm，3.5 μm。柱溫35 ℃，進(jìn)樣量3 μL，流速0.5 mL/min。質(zhì)譜方法為：電噴霧電離( ESI) 源，正負(fù)離子電離模式。離子源溫度(120 ℃，脫溶劑溫度500 ℃，脫溶劑氮?dú)饬?00 L/h，錐孔反吹氮?dú)?0 L/ h。正負(fù)離子模式毛細(xì)管電離電壓分別為3.0 kV和4.5 kV，取樣錐孔電壓為27 eV，萃取錐孔4 eV，四極桿掃描范圍m/z50～1 500。使用Analysis TF 1.6和MarkerView 1.2.1軟件(美國(guó)AB SCIEX)進(jìn)行數(shù)據(jù)收集，并使用MetaboAnalyst 3.0軟件對(duì)差異化合物進(jìn)行分析和篩選。差異化合物的篩選標(biāo)準(zhǔn)為FC>1.5 or <0.67,P<0.05,VIP>1。將選定的差異化合物與HMDB(人類代謝組數(shù)據(jù)庫(kù))數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，以確定特定物質(zhì)。

1.2.4 J2趨化性試驗(yàn) 將直徑為5 cm的培養(yǎng)皿底部通過兩個(gè)內(nèi)外環(huán)劃分成16部分。先在培養(yǎng)皿中倒入0.8 %瓊脂糖約5 mL，待凝固后備用。在RE區(qū)域內(nèi)加入20 μL待測(cè)的根系分泌物或加巴噴丁溶液，將20 μL內(nèi)含有約30頭J2懸浮液接種于中心環(huán)N區(qū)域，在26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗放置24 h。在顯微鏡下分別統(tǒng)計(jì)1～8區(qū)及中心N區(qū)域的根結(jié)線蟲數(shù)量[8]。

吸引指數(shù)=1～8區(qū)域J2總數(shù)/(N區(qū)域J2總數(shù)-1～8區(qū)域J2總數(shù))×100%。

1.2.5 J2死亡率試驗(yàn) 在12孔板上對(duì)不同濃度(1、0.1、0.01 mM)的加巴噴丁溶液進(jìn)行J2死亡率試驗(yàn)，每種濃度試驗(yàn)6次。至少進(jìn)行了3次獨(dú)立試驗(yàn)[8]。對(duì)照組由乙醇和蒸餾水組成。在加入不同濃度的加巴噴丁之前，每個(gè)孔加入20 μL含有30～50頭 J2s的液滴。在26 ℃培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)24 h后，用40倍顯微鏡計(jì)數(shù)不活動(dòng)線蟲數(shù)量用于計(jì)算死亡率。

死亡率=不活動(dòng)線蟲數(shù)量/總線蟲數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄根系分泌物代謝組結(jié)果分析

通過對(duì)收集的番茄根系分泌物進(jìn)行代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在根系分泌物中含有多種成分。根系分泌物的主要成分一共檢測(cè)到2 000多種物質(zhì)，其中主要包含氨基酸，肽及其類似物，苯醚類，苯酚類，苯甲酸及其衍生物，β-羥基酸及其衍生物，膽汁醇、酸及其衍生物，碳水化合物及其結(jié)合物等。對(duì)這些物質(zhì)進(jìn)行篩選后將可購(gòu)得的物質(zhì)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)(表1為番茄分泌物成分部分)。其中，在根系分泌物中加巴噴丁是存在其中的，其相對(duì)含量為80.626 2。加巴噴丁在根系分泌物中并不是含量最多的物質(zhì)，相對(duì)其他物質(zhì)來說其含量很少，其所起的作用可能和其含量關(guān)系不大。該物質(zhì)的核質(zhì)比為172.131，CAS號(hào)為60142-96-3，室溫下呈白色粉末至灰白色結(jié)晶粉末，其理化性質(zhì)穩(wěn)定。

表1 番茄分泌物代謝組部分信息

2.2 趨化性結(jié)果分析

如表2所示，通過對(duì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲(J2)進(jìn)行趨化性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Gabapentin溶液的濃度為1 mM時(shí)，對(duì)J2有明顯的排斥作用；當(dāng)濃度稀釋至0.1、0.01 mM時(shí)，Gabapentin對(duì)J2無明顯吸引或是排斥現(xiàn)象，對(duì)照表現(xiàn)出相同現(xiàn)象。

表2 根系分泌物及不同濃度加巴噴丁對(duì)J2的趨化性

2.3 J2死亡率結(jié)果分析

如圖1所示，通過對(duì)J2進(jìn)行死亡率試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)濃度為1 mM和0.1 mM時(shí)，24 h線蟲死亡率分別達(dá)到93%、95%；當(dāng)濃度為0.01 mM和0.001 mM時(shí)，24 h線蟲死亡率分別為72%、75%；當(dāng)濃度稀釋到0.000 1 mM時(shí)死亡率下降到26%，雖然與對(duì)照相比仍有顯著差異，但是由于死亡率已經(jīng)低于50%，致死作用弱。

圖1 不同濃度加巴噴丁對(duì)J2的致死率比較(P<0.01)

綜上所述，通過LC/GC-MS發(fā)現(xiàn)在番茄根系分泌物中含有一種名為加巴噴丁的化學(xué)物質(zhì)，該物質(zhì)室溫下化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定；通過J2體外趨化性和死亡率試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加巴噴丁溶液濃度為1 mM時(shí)，對(duì)J2有明顯的排斥作用并且J2死亡率高達(dá)92 %；當(dāng)濃度為0.1～0.001 mM時(shí)，加巴噴丁溶液對(duì)J2無明顯排斥現(xiàn)象，但J2的死亡率依舊超過70%。這說明加巴噴丁溶液在濃度為1 mM時(shí)對(duì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲(J2)有明顯的抑制作用。

3 討 論

目前來說，人們?cè)絹碓街匾曓r(nóng)作物生產(chǎn)過程中的綠色、安全問題。有報(bào)道指出原來使用廣泛的殺線劑克百威、滅線磷、涕滅威可以明顯的減少線蟲的遷移、侵染和取食，進(jìn)而減少線蟲對(duì)作物和蔬菜的危害，但是這些物質(zhì)的高毒性對(duì)其它有益蟲鳥有一定危害，還會(huì)對(duì)人造成二次毒害。在2018年10月1日后全面禁止克百威、滅線磷、涕滅威已禁止在蔬菜、果樹、茶樹、中草藥材上使用[9]。隨著越來越多高毒性殺線劑被禁止使用，殺線劑的研制也更多的傾向更安全可靠的的植物源化學(xué)物質(zhì)上來。先正達(dá)的生物殺線蟲劑 Clariva PN(活性成分:巴斯德桿菌PN1，Pasteuria nishizawaePN1) 獲得巴西登記[10]。孟山都將在巴西上市殺線蟲劑NemaStrike(活性成分：tioxazafen)，該活性成分具有低毒性，殺線持久性的特點(diǎn)[10]。關(guān)于根系分泌物對(duì)根結(jié)線蟲有影響的研究報(bào)道不斷出現(xiàn)。萜類化合物(芫花萜、棉酚等)、類黃酮(黃酮醇等)、糖苷(芥子油苷等)、脂肪酸(丁酸、二烯酸等)和揮發(fā)性有機(jī)分子(香油、香葉醇、芳樟醇等)調(diào)節(jié)根結(jié)線蟲二齡幼蟲(J2)對(duì)植物宿主的吸引和排斥[11,12]；豆科植物和玉米(Zeamays)的根系分泌物可以減緩甚至停止線蟲的運(yùn)動(dòng)，以此來降低線蟲感染植物的能力[13]；易感大豆根系分泌物中所包含的谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸和苯丙氨酸可吸引大豆孢囊線蟲[14]；柑橘根系分泌物種中的α-松萜、檸檬烯和β-松萜等萜類物質(zhì)可以吸引柑橘根結(jié)線蟲[15,16]；將番茄與茼蒿間作，茼蒿根系分泌物中的月桂酸可以擾亂線蟲中Mi-flp-18基因的表達(dá)以阻止其感染番茄[17]。當(dāng)接種南方根結(jié)線蟲時(shí)，L-抗壞血酸2,6-棕櫚酸酯，鄰苯二甲酸二丁酯，鄰苯二甲酸二甲酯和2,6-二叔丁基-對(duì)甲酚四種成分顯著增加，這些化合物中的每一種都能抑制南方根結(jié)線蟲的卵孵化，增加了根結(jié)線蟲二齡幼蟲的死亡率[18]。一種植物源的物質(zhì)尸胺對(duì)南方根結(jié)線蟲有明顯的吸引作用，該物質(zhì)在番茄的根系分泌物中也有檢測(cè)到，但是番茄根系分泌物對(duì)南方根結(jié)線蟲并無明顯吸引作用，這可能是由于番茄的根系分泌物中存在某些與之拮抗的物質(zhì)導(dǎo)致[19]。這些研究報(bào)道為抗根結(jié)線蟲病指明了研究方向。

通過這些研究以及本試驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，開發(fā)植物源的化學(xué)物質(zhì)用于抵抗根結(jié)線蟲對(duì)番茄株系的入侵的方式是有理可據(jù)的。本試驗(yàn)中，在1mM濃度下植物源的加巴噴丁溶液對(duì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲(J2)有明顯的排斥作用，并且對(duì)J2的死亡率高達(dá)到90 %以上，效果是明顯的。加巴噴丁這種物質(zhì)還需要更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)奶镩g試驗(yàn)來確定其真正的抗線蟲能力。為了能夠更加有效環(huán)保的防治根結(jié)線蟲病，安全綠色的殺線劑的研究仍是人們前進(jìn)的方向。