杜楊，杜磊

（1.河南省安陽市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中心，河南安陽 455000；2.安陽工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，河南安陽 455000）

氟苯尼考屬于氯霉素類（CAPs）［1］，包括氯霉素（CAP）及其衍生物，又稱酰胺醇類。氟苯尼考為動(dòng)物專用的半合成酰胺醇類抗生素，其特點(diǎn)是抗菌譜廣、體內(nèi)分布廣泛、注射或內(nèi)服均吸收良好［2］。氟苯尼考（FF）具有較強(qiáng)的免疫抑制作用［3］，并具有胚胎毒性［4］。隨著FF 在獸醫(yī)臨床的大量使用，其耐藥菌株也在不斷增加。

動(dòng)物源性食品中CAPs 及其代謝產(chǎn)物的殘留檢測(cè)方法主要包括高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）、液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）、酶聯(lián)免疫法（ELISA），其中確證方法主要是質(zhì)譜法［5］。本試驗(yàn)參照《GB/T 22338-2008 動(dòng)物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測(cè)定》，提出相應(yīng)改進(jìn)措施，在確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確與可靠的前提下，簡(jiǎn)化前處理過程，縮短前處理時(shí)間，對(duì)提高雞蛋中氟苯尼考?xì)埩魴z測(cè)的工作效率具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材 除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682 規(guī)定的一級(jí)水。甲醇：色譜純，乙腈：色譜純，氨水，正己烷，乙酸乙酯，氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99.0%；微孔濾頭（尼龍）：孔徑0.22 μm。

1.2 儀器設(shè)備 天平：感量0.01 g、0.000 01 g，高速冷凍離心機(jī)：≥8 000 r/min，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：帶電噴霧離子源，移液器：100 μL、1 000 μL，氮吹儀，均質(zhì)器，多管渦旋振蕩器。

1.3 儀器條件 色譜柱：ACQUITY UPLCTM BEH C18（1.7 μm，2.1×100 mm）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：2.00 μL；流動(dòng)相：A乙腈，B水。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、中間液及工作液配制 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100 μg/mL）：準(zhǔn)確稱取約10.0 mg 氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（精確到0.1 mg）于100 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成100 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（-20 ℃保存4個(gè)月）。

標(biāo)準(zhǔn)中間液（1 000 ng/mL）：準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100 μg/mL）1 mL 于100 mL 容量瓶中，用20%甲醇定容至刻度，配制成1 000 ng/mL 標(biāo)準(zhǔn)中間液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

標(biāo)準(zhǔn)工作液（5 ng/mL）：準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)中間液（1 000 ng/mL）1 mL 于200 mL 容量瓶中，用20%甲醇定容至刻度，配制成5 ng/mL 標(biāo)準(zhǔn)工作液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

1.4.2 提取 稱取樣品5 g（±0.01 g）置于50 mL離心管中，加標(biāo)準(zhǔn)工作液100 μL（100 ng/mL）、氨水0.25 mL、乙酸乙酯7.5 mL，渦旋振蕩10 min，8 000 r/min 離心5 min，將上層乙酸乙酯轉(zhuǎn)移至另一50 mL 離心管中。再加氨水0.25 mL、乙酸乙酯7.5 mL，渦旋振蕩10 min，8 000 r/min 離心5 min，合并上層液，55 ℃氮?dú)獯蹈伞Ｍ瑫r(shí)制作陽性對(duì)照樣品，在5 g（±0.01 g）空白樣品中加標(biāo)準(zhǔn)中間液100 μL（100 ng/mL），添加濃度為2.0 μg/kg（上機(jī)濃度為5 ng/mL）。

1.4.3 凈化 加正己烷2 mL 輕輕渦旋混勻，加20%甲醇2.0 mL 用手搖勻（注：若有乳化，取下清液于1.5 mL離心管中21 000 r/min離心；或者放入氮吹儀中加熱5 min），14 000 r/min 離心5 min，取下清液（用1 mL注射器吸取）過濾膜（若渾濁就再過一次）后供LC-MS/MS檢測(cè)。

1.4.4 定量方法 基質(zhì)單點(diǎn)，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，計(jì)算公式如下：

式中，A為供試溶液中氟苯尼考的峰面積；AS為標(biāo)準(zhǔn)品溶液氟苯尼考的峰面積；CS為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（ng/mL）；V為定容體積（mL）；m為稱樣量（g）。

2 注意事項(xiàng)

蛋類有時(shí)會(huì)產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，吸取的上清液體積往往少于加入的乙酸乙酯體積，如果提取一遍，用外標(biāo)法校正時(shí)會(huì)導(dǎo)致回收率偏低，故可以重復(fù)提取一次，使得提取更加完全；脫脂時(shí)應(yīng)輕搖，避免用力過大造成乳化；高速冷凍離心的時(shí)候應(yīng)該選用質(zhì)量好的離心管，普通國(guó)產(chǎn)離心管在高速離心時(shí)可能會(huì)碎裂；過濾時(shí)用注射器小心吸取離心后的下清液，盡量避免吸到沉淀和上浮的雜質(zhì)，普通國(guó)產(chǎn)濾膜即可達(dá)到效果，個(gè)別渾濁的可用進(jìn)口濾膜過濾。

3 結(jié)果分析

本方法依據(jù)《GB/T 22338-2008 動(dòng)物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測(cè)定》提出了較多的改進(jìn)。國(guó)標(biāo)中涉及的檢測(cè)對(duì)象為動(dòng)物組織、肝腎、水產(chǎn)品及蜂蜜，沒有專門針對(duì)雞蛋的前處理方法。本次在國(guó)標(biāo)方法的基礎(chǔ)上專門針對(duì)雞蛋給出了具體前處理方法。在提取過程中，國(guó)標(biāo)方法用乙腈飽和正己烷、正丙醇、丙酮-正己烷等試劑多次提取轉(zhuǎn)移，相對(duì)于國(guó)標(biāo)方法本試驗(yàn)提取過程中僅用到了氨水、乙酸乙酯，提取過程簡(jiǎn)易清晰，提取充分。國(guó)標(biāo)方法的凈化過程要使用LC-Si 硅膠小柱、旋蒸儀、氮吹儀及丙酮正己烷淋洗、洗脫，而本改進(jìn)方法中凈化過程不用硅膠小柱、旋蒸、氮吹，僅使用20%甲醇復(fù)溶和離心機(jī)。在同樣添加濃度為2.0 μg/kg 情況下，國(guó)標(biāo)方法回收率在70%～90%之間，而本試驗(yàn)方法回收率達(dá)到100%～110%，平行樣間結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.96%，實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差5.4%，檢測(cè)限為0.1 μg/kg。

綜上，本次改進(jìn)方法的前處理過程簡(jiǎn)單、高效、準(zhǔn)確，大大提高了工作效率；對(duì)人體有害的有機(jī)試劑使用較少；節(jié)省實(shí)驗(yàn)耗材，減少前處理設(shè)備的使用。在社會(huì)效益與經(jīng)濟(jì)效益上具有不可估量的作用。