張玨鋒 張琴 李芳 鐘海英 陳建明,*

(1 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)與微生物研究所， 杭州 310021；2 杭州市林業(yè)科學(xué)研究院， 杭州 310021；*通信聯(lián)系人，E-mail：chenjm63@163.com)

昆蟲(chóng)中腸微生物對(duì)寄主的繁殖[1]、抵御外來(lái)微生物入侵[2]、提高免疫力等均發(fā)揮著重要的作用。已有研究表明，除與害蟲(chóng)抗性性增強(qiáng)有關(guān)的殺蟲(chóng)劑靶標(biāo)位點(diǎn)轉(zhuǎn)移、害蟲(chóng)解毒酶的高表達(dá)以及藥物排泄能力增加之外[3-4]，害蟲(chóng)中腸微生物可能與寄主抗藥性存在某種關(guān)聯(lián)。張浩等[5]的研究表明，棉鈴蟲(chóng)(Helicover pa armigera)腸道菌在蘇云金芽孢桿菌(Bt)殺蟲(chóng)過(guò)程中對(duì)宿主具有保護(hù)作用，并檢測(cè)到一株能有效降低Bt毒素對(duì)寄主殺蟲(chóng)活性的菌株；點(diǎn)蜂緣蝽(Riptortus pedestris)中腸存在能降解殺螟硫松(Fenitrothion)的Burkholderia屬細(xì)菌[6]。去除腸道菌的德國(guó)小蠊(Blattella germanica)比敏感品系的抗性水平還低，PCR-DGGE 結(jié)果顯示敏感品系與抗性品系的德國(guó)小蠊腸道圖譜電泳條帶數(shù)量和遷移率存在差異[7-8]。用從小菜蛾(Plutella xylostella)腸道中分離純化的厚壁菌門(mén)細(xì)菌腸球菌(Enterococussp)、沙門(mén)菌(Serratiasp)以及抗生素分別飼喂小菜蛾，腸球菌顯著提高了小菜蛾對(duì)毒死蜱的抗性，沙門(mén)菌顯著降低了小菜蛾對(duì)毒死蜱的抗性，抗生素清除腸道細(xì)菌后，小菜蛾的抗藥性顯著增強(qiáng)[9,10]。

二化螟[Chilo suppressalis(Walker)]屬鱗翅目(Lepidoptera)螟蛾科(Pyralidae)，是我國(guó)水稻上的重要害蟲(chóng)。近年，由于耕作制度改變、抗藥性產(chǎn)生等影響，越冬代有效蟲(chóng)源面積擴(kuò)大，加劇了二化螟的危害[11,12]。氯蟲(chóng)苯甲酰胺自2008 年正式注冊(cè)以來(lái)，在我國(guó)被大范圍應(yīng)用于二化螟的田間防治[13]。然而近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)不同地理種群的二化螟對(duì)氯蟲(chóng)苯甲酰胺的抗性水平已經(jīng)存在顯著差異[14-16]，如2017 年報(bào)道浙江地區(qū)二化螟種群已對(duì)氯蟲(chóng)苯甲酰胺產(chǎn)生了中高水平的抗性[17]。目前有關(guān)二化螟對(duì)于氯蟲(chóng)苯甲酰胺抗性產(chǎn)生機(jī)制已有較多研究[18-19]，我們的研究發(fā)現(xiàn)不同抗藥性水平的二化螟種群在中腸微生物群落的組成與結(jié)構(gòu)上存在差異，推測(cè)可能與二化螟抗藥性差異有關(guān)[20]。為證實(shí)二化螟中腸菌群在寄主對(duì)氯蟲(chóng)苯甲酰胺抗性產(chǎn)生過(guò)程中的作用，本研究采用宏基因組測(cè)序以及傳統(tǒng)微生物分離純培養(yǎng)的方法研究不同濃度氯蟲(chóng)苯甲酰胺處理的二化螟種群中腸細(xì)菌類微生物多樣性，以期為闡明二化螟對(duì)氯蟲(chóng)苯甲酰胺產(chǎn)生抗藥性的機(jī)理以及預(yù)防和治理二化螟的抗藥性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)與藥劑

供試二化螟蟲(chóng)源采集于浙江海寧田間，對(duì)氯蟲(chóng)苯甲酰胺抗性倍數(shù)為 52.72，飼養(yǎng)于浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所人工氣候室內(nèi)，溫度為28℃±0.5℃；光周期為16 h 光照/8 h 黑暗；長(zhǎng)期茭白飼喂，4 齡幼蟲(chóng)用于試驗(yàn)。

供試藥劑為95%氯蟲(chóng)苯甲酰胺原藥。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

藥劑配置：氯蟲(chóng)苯甲酰胺原藥溶于二甲基亞砜，配置成 100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL 溶液，0.23 μm 濾頭過(guò)濾后備用，以二甲基亞砜溶液為對(duì)照。

試蟲(chóng)處理：45 日齡水稻苗分株洗凈，晾干，對(duì)照及上述3 種濃度溶液浸泡30 s 后分別放入罐頭瓶中，根部包裹紗布并保濕，每瓶中接入4 齡二化螟幼蟲(chóng)20 頭，每濃度處理200 頭蟲(chóng)子，24 h、48 h、72 h 后取樣，每次取樣30 頭4 齡二化螟幼蟲(chóng)，其中100 μg/mL 氯蟲(chóng)苯甲酰胺溶液24 h、48 h 和72 h處理命名為 100_24h、100_48h、100_72h；200 μg/mL氯蟲(chóng)苯甲酰胺溶液24 h、48 h 和72 h 處理命名為200_24h、200_48h、200_72h；400 μg/mL 氯蟲(chóng)苯甲酰胺溶液24 h、48 h 和72 h 處理命名為400_24h、400_48h、400_72h；二甲基亞砜溶液24 h、48 h 和72 h 處理命名為 CK_24h、CK_48h、CK_72h，并解剖取中腸用于下一步實(shí)驗(yàn)。

中腸細(xì)菌 DNA 的提取：二化螟中腸去除內(nèi)含物之后無(wú)菌水漂洗，細(xì)菌 DNA 提取試劑盒(OMEGA , USA )提取中腸細(xì)菌類微生物DNA。

Illumina PE250 測(cè)序：中腸細(xì)菌類微生物DNA檢測(cè)質(zhì)量稀釋后作為模板，根據(jù)測(cè)序區(qū)域的選擇，使用帶 Barcode 的特異引物，PCR 擴(kuò)增(表1)之后割膠回收產(chǎn)物?；厥?DNA 片段的一端與引物堿基互補(bǔ)，固定在芯片上；另一端隨機(jī)與附近的另外一個(gè)引物互補(bǔ)，形成“橋 (bridge)”產(chǎn)生 DNA 簇；DNA 擴(kuò)增子線性化成為單鏈。加入改造過(guò)的DNA聚合酶和帶有4 種熒光標(biāo)記的dNTP，每次循環(huán)只合成一個(gè)堿基；用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類；將“熒光基團(tuán)”和“終止基團(tuán)”化學(xué)切割，恢復(fù)3'端黏性，繼續(xù)聚合第二個(gè)核苷酸；統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果，獲知模板DNA 片段的序列。Illumina PE250 測(cè)序得到的雙末端讀長(zhǎng)(PE reads)首先進(jìn)行拼接、質(zhì)控和過(guò)濾，區(qū)分樣本后進(jìn)行 OTU 聚類分析和物種分類學(xué)分析，對(duì)優(yōu)化序列提取非重復(fù)序列，降低分析中間過(guò)程冗余計(jì)算量，去除沒(méi)有重復(fù)的單序列，按照 97% 相似性對(duì)非重復(fù)序列(不含單序列) 進(jìn)行OTU 聚類，基于OTU 聚類分析結(jié)果，可以對(duì) OTU 進(jìn)行多種多樣性指數(shù)分析，以及對(duì)測(cè)序深度的檢測(cè)；基于分類學(xué)信息，可以在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。在上述分析的基礎(chǔ)上，可以進(jìn)行一系列群落結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育等深入的統(tǒng)計(jì)學(xué)和可視化分析。

二化螟中腸分離：供試二化螟4 齡幼蟲(chóng)20 頭，分為4 組，分別解取中腸后75%酒精清洗、勻漿后加入10 mL ddH2O 稀釋，用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

LB 固體培養(yǎng)基配制：950 mL ddH2O 加入胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，加熱融解后分裝，調(diào)pH 至7.0，ddH2O 定容至1 L，高壓蒸汽滅菌21 min 后取出待用。

表1 不同處理二化螟試蟲(chóng)中腸細(xì)菌群落多樣性指數(shù)Table 1. Bacterial community richness, diversity indices of midgut in Chilo suppressalis under different treatments.

二化螟中腸細(xì)菌類微生物的培養(yǎng)：在1 mL 中腸研磨液中分別加入1 mL 上述3 個(gè)濃度氯蟲(chóng)苯甲酰胺溶液和9 mL LB 固體培養(yǎng)基混勻后置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個(gè)濃度3 個(gè)重復(fù)，以ddH2O 為對(duì)照處理。48 h 后用牙簽挑取培養(yǎng)菌落，每個(gè)濃度挑取30 個(gè)菌斑，置于5 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)后離心收集菌體提取DNA。

基因組DNA 的提取：細(xì)菌DNA 的提取采用細(xì)菌DNA 提取試劑盒(OMEGA，USA)進(jìn)行，提取的DNA 用于進(jìn)一步 PCR，PCR 參考張玨鋒等[20]，PCR產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理二化螟體內(nèi)細(xì)菌群落多樣性分析

本次測(cè)序的二化螟中腸所有 12 個(gè)樣品，測(cè)序深度均在99.00%以上，能夠代表各個(gè)樣本中腸細(xì)菌種群的真實(shí)情況(表1)。Chao 指數(shù)與Ace 指數(shù)通常用于描述細(xì)菌群落多樣性，兩者都可用來(lái)估計(jì)群落中含有OTU 數(shù)目的指數(shù)，表1 中，對(duì)照24 h 處理(CK_24h)的指數(shù)(Chao、Ace)平均值最高，為 1123和3.91；200_48h 處理的Ace 平均值為12 個(gè)測(cè)序樣品中最低(415)。辛普森指數(shù)與香農(nóng)指數(shù)也用于描述群落多樣性，前者指數(shù)值越大，說(shuō)明群落多樣性越低，后者值越大，說(shuō)明群落多樣性越高。表1 結(jié)果顯示，CK_24h 處理辛普森指數(shù)最低，同樣該處理香農(nóng)指數(shù)最高。

2.2 OTUs 統(tǒng)計(jì)及分類學(xué)分析

圖1 不同處理二化螟試蟲(chóng)中腸細(xì)菌類微生物OUT韋恩圖分析Fig. 1. Venn analysis of the number and community of intestinal bacteria of Chilo suppressalis under different treatments.

圖2 基于屬水平不同處理二化螟體內(nèi)中腸細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig. 2. Genera of intestinal bacteria found in different treated Chilo suppressalis population.

由韋恩圖(圖1)分析結(jié)果可知：對(duì)照二化螟試蟲(chóng)中腸細(xì)菌類微生物群落OTUs 為1346 個(gè)，多于氯蟲(chóng)苯甲酰胺處理的二化螟試蟲(chóng)，氯蟲(chóng)苯甲酰胺100、200、400 μg/mL 處理種群中腸細(xì)菌類微生物群落OTUs 分別為 748 個(gè)、813 個(gè)、875 個(gè)。3 個(gè)不同濃度氯蟲(chóng)苯甲酰胺處理的二化螟種群中特有的 OUT數(shù)量分別為 29(100 μg/mL)、71(200 μg/mL)、57(400μg/mL)，均小于對(duì)照處理的410。

2.3 不同處理二化螟中腸細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

由圖2 可知，對(duì)相似水平達(dá) 97%的OTU 代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，從而得到不同樣品中每個(gè)OTU 對(duì)應(yīng)的物種分類信息。在屬的分類水平上，注釋到明確分類地位的有29 個(gè)屬(圖2)。在對(duì)照二化螟種群中腸微生物中比例較高的擬桿菌屬(Bacteroides)在處理種群中有所降低，在 100_72h中的比例較高但也僅為8.16%；但腸道致病菌摩根氏菌屬(Morganella)與普羅威登斯菌屬(Providencia)的比例顯著升高，前者從CK_24h 的3.48%上升至100_24h 的36.84%，200_24h 的55.10%和400_24h的19.09%；后者在對(duì)照種群中的3 個(gè)時(shí)間段的含量分別為4.40%、5.80%和0.50%，而在處理種群中的最高比例達(dá)到 35.16%(100_48h)，即使在相對(duì)含量較低的400_48h 處理中，比例也達(dá)到3.17%，高于對(duì)照處理中的0.50%。推測(cè)氯蟲(chóng)苯甲酰胺的施用會(huì)對(duì)二化螟中腸內(nèi)某些細(xì)菌類微生物比例及優(yōu)勢(shì)度造成影響。變形菌屬(Proteus)在對(duì)照種群 3 個(gè)時(shí)間段內(nèi)的含量均較低，而在處理種群內(nèi)含量相對(duì)較高。

2.4 COG 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比

16S rRNA 功能預(yù)測(cè)是通過(guò)PICRUSt 對(duì)OUT豐度表進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，對(duì)應(yīng)Greengene ID 獲得OUT對(duì)應(yīng)的COG 家族信息和KO 信息及其豐度，并預(yù)測(cè)基因進(jìn)行COG 功能分類，結(jié)果如圖3 所示。對(duì)照種群24 h 處理 (CK_24h) 染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與動(dòng)力學(xué)相關(guān) (Chromatin structure and dynamics) 基因數(shù)為 11 452，高于100 μg/mL、200 μg/mL 及 400 μg/mL氯蟲(chóng)苯甲酰胺 24 h 處理種群(100_24h、200_24h、400_24h)的1274、1355 與1737；同樣對(duì)照種群24 h處理 (CK_24h) 的防御機(jī)制 (Defense mechanisms)相關(guān)基因數(shù)1 058 083 也高于其余3 個(gè)處理種群的872 261、639 857 及732 004。除此之外，4 個(gè)種群在其余各功能分類基因數(shù)量上并無(wú)差異。

圖3 不同處理二化螟試蟲(chóng)COG 功能預(yù)測(cè)Fig. 3. COG classification of intestinal bacteria of Chilo suppressalis in different treatments.

2.5 KEGG 分析結(jié)果

由KEGG 的功能預(yù)測(cè)結(jié)果可見(jiàn)，對(duì)照種群各個(gè)時(shí)間段的結(jié)果與處理試蟲(chóng)的結(jié)果無(wú)明顯差異，主要集中于膜轉(zhuǎn)運(yùn)(membrane transport)、碳代謝(carbohydrate metabolism)、氨基酸代謝(amino acid metabolism)、復(fù)制與修復(fù)(replication and repair)，其中膜轉(zhuǎn)運(yùn)(membrane transport)的相對(duì)豐度在氯蟲(chóng)苯甲酰胺處理中均為 0.16，略高于 3 個(gè)對(duì)照的均值0.1。

2.6 氯蟲(chóng)苯甲酰胺誘導(dǎo)培養(yǎng)二化螟中腸細(xì)菌測(cè)序結(jié)果

由表2 可知，在含有不同濃度氯蟲(chóng)苯甲酰胺溶液的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的二化螟中腸細(xì)菌類微生物種類存在差異，對(duì)照處理測(cè)序成功的 19 株菌株，除去Leclercia adecarboxylata，其余均屬腸桿菌屬(Enterobacter)；100 μg/mL 處理測(cè)序成功的 26 株菌株中除 3 株無(wú)法培養(yǎng)外(uncultured bacterium)，18株屬腸桿菌屬(Enterobacter)，另有Lelliottia nimipressuralis、Klebsiellasp.、Enterobacter kobei、Leclercia adecarboxylata、Pantoea agglomerans和Pantoeasp. DAP16 等 5 株菌株；200 μg/mL 處理中除 13 株屬腸桿菌屬(Enterobacter)外，其余菌株與100 μg/mL 一致；400 μg/mL 中除Enterobacter外，另 檢 測(cè) 到Leclercia adecarboxylata、Pantoea agglomerans及Pantoeasp. DAP16 三種菌與 100μg/mL 及 200 μg/mL 培養(yǎng)結(jié)果略有差異。

3 討論

本研究中氯蟲(chóng)苯甲酰胺溶液不同濃度處理能降低二化螟中腸細(xì)菌類微生物豐度及多樣性，處理種群中腸細(xì)菌類微生物的OUT 數(shù)值、特有OUT 數(shù)值均低于未處理種群。推測(cè)由于昆蟲(chóng)腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)組成易受食物、生存環(huán)境、腸道理化因子以及免疫系統(tǒng)等諸多因素的影響[17]，因而外源氯蟲(chóng)苯甲酰胺的處理致使二化螟中腸微生物的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。已有研究表明，昆蟲(chóng)腸道菌群結(jié)構(gòu)豐度與寄主對(duì)化學(xué)殺蟲(chóng)劑的抗性存在某種關(guān)聯(lián)，如棉鈴蟲(chóng)抗性種群的中腸細(xì)菌類微生物的豐富度顯著高于敏感種群[21]；而夏曉峰[10]的研究發(fā)現(xiàn)利用抗生素清除腸道細(xì)菌后，小菜蛾(Plutella xylostella)的抗藥性反而得到顯著增強(qiáng)。因而進(jìn)一步推測(cè)，本研究中處理種群細(xì)菌類微生物群落結(jié)構(gòu)豐度降低等可能與寄主昆蟲(chóng)對(duì)氯蟲(chóng)苯甲酰胺抗性的產(chǎn)生存在關(guān)聯(lián)。而對(duì)照處理的3 個(gè)時(shí)間段之間基于屬水平細(xì)菌菌群落結(jié)構(gòu)存在一定差異，推測(cè)與二化螟齡期轉(zhuǎn)變及增長(zhǎng)有關(guān)[22]。

昆蟲(chóng)腸道微生物對(duì)于宿主有著重要作用，其菌群結(jié)構(gòu)、組成、豐度以及功能的改變均為抵御和消除外源因子對(duì)于昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育與繁殖等的影響[23,24]。隨著化學(xué)殺蟲(chóng)劑的廣泛應(yīng)用，相應(yīng)的害蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑抗性問(wèn)題也日益嚴(yán)重。多項(xiàng)研究表明，某些昆蟲(chóng)的共生細(xì)菌具有降解化學(xué)殺蟲(chóng)劑的能力[25,26]，這表明昆蟲(chóng)的共生細(xì)菌有可能與寄主抗藥性的產(chǎn)生有關(guān)。果蠅腸道菌(Bactrocera dorsalis)可提高寄主對(duì)敵百蟲(chóng)(trichlorphon)的抗性[27]；枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) SWL-19 能明顯減輕氟對(duì)家蠶的脅迫[28]。劉金萍等[29]通過(guò) KEGG 代謝途徑分析，推測(cè)高濃度CO2脅迫下，棉鈴蟲(chóng)中腸微生物具有降解有毒物質(zhì)作用。氯蟲(chóng)苯甲酰胺的施用致使宿主通過(guò)其菌群結(jié)構(gòu)、組成及功能的改變消除其造成的不良影響，從而導(dǎo)致本研究中摩根氏菌屬(Morganella)、普羅威登斯菌屬(Providencia)以及變形菌屬(Proteus)在處理種群中的比例顯著升高；培養(yǎng)結(jié)果顯示氯蟲(chóng)苯甲酰胺處理獲得的培養(yǎng)菌株除腸桿菌屬外，還存在Lelliottia nimipressuralis、Klebsiella sp.、Enterobacter kobei、Leclercia adecarboxylata、Pantoea agglomerans等多種其他菌屬。由此推測(cè)，二化螟腸道內(nèi)細(xì)菌類微生物對(duì)氯蟲(chóng)苯甲酰胺的敏感性存在差異；同時(shí)離體培養(yǎng)結(jié)果也說(shuō)明氯蟲(chóng)苯甲酰胺脅迫致使二化螟中腸內(nèi)某些特定功能的細(xì)菌類微生物比例及優(yōu)勢(shì)度發(fā)生改變。

圖4 基于宏基因組測(cè)序KEGG 功能預(yù)測(cè)Fig. 4. KEGG function prediction based on macrogenomic sequencing.

表2 二化螟中腸細(xì)菌類微生物離體培養(yǎng)測(cè)序結(jié)果Table 2. Isolation and identification of bacteria from the midgut of Chilo suppressalis.

自然環(huán)境中的微生物群落功能組成與環(huán)境因子密切相關(guān)，相似環(huán)境中的微生物群落功能更相似，而行使功能的微生物物種組成可能差異較大[30、31]。因而除了不同環(huán)境中的微生物群落結(jié)構(gòu)組成之外，揭示微生物群落功能更為重要。本研究中根據(jù)16S測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行基于KEGG和eggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)的功能預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度氯蟲(chóng)苯甲酰胺處理二化螟種群與對(duì)照種群在各功能分類基因數(shù)量及豐度上無(wú)明顯差異，推測(cè)由于本研究中氯蟲(chóng)苯甲酰胺處理最長(zhǎng)時(shí)間僅72 h，外源化學(xué)殺蟲(chóng)劑脅迫時(shí)間過(guò)短，不足以使二化螟中腸微生物群落功能發(fā)生改變，處理時(shí)間的延長(zhǎng)是否會(huì)使群落功能發(fā)生變化還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

總之腸道微生物與寄主昆蟲(chóng)協(xié)同發(fā)展的過(guò)程中，通過(guò)何種機(jī)制抵御外源不良因子的脅迫，調(diào)節(jié)維持腸道微生物群落結(jié)構(gòu)、豐度、功能來(lái)維持菌群的穩(wěn)態(tài)平衡，維護(hù)寄主昆蟲(chóng)的利益目前還不明確，需進(jìn)一步研究。