冉詠蘭,闞建全

(西南大學 食品科學學院，重慶， 400715)

蘿卜(Raphanussati usL.)為十字花科蘿卜屬作物，是我國重要的大眾化蔬菜，其肉質根富含植物蛋白、維生素C、膳食纖維和多種微量元素，具有很高的食用和藥用價值。2017年我國蘿卜種植面積達130萬hm2，總產(chǎn)量達4501萬t[1]。地膜因其保溫保墑、抑制雜草等功能，在蘿卜種植中被廣泛使用，2015年我國地膜用量145.5萬t，覆蓋面積1831.8萬hm2[2]，鄰苯二甲酸酯類化合物(phthalic acid easters，PAEs)作為增塑劑被添加到塑料中，由于在環(huán)境中具有性質穩(wěn)定，半衰期長，生物蓄積毒性較強等特性[3]，美國國家環(huán)保局已將鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(diethylhexyl phthalate,DEHP)、鄰苯二甲酸二丁酯(di-n-butyl ortho-phthalate ,DBP)、鄰苯二甲酸丁基芐基酯(benzyl-n-butyl ortho-phthalate ,BBP)、鄰苯二甲酸二甲酯(dimethyl ortho-phthalate ,DMP) 、鄰苯二甲酸正二辛酯(di-n-octyl ortho-phthalate ,DnOP)、鄰苯二甲酸二乙酯(dicthyl ortho-phthalate ,DEP) 6種 PAEs 列為優(yōu)先控制的有毒污染物[4-5]。DEHP作為一種常見的PAEs，在農(nóng)業(yè)土壤中的濃度高于其他種類的 PAEs，有研究表明廣州、深圳蔬菜基地土壤中6種PAEs的總含量為3.00～45.67 mg/kg，其中DEHP含量為1.86～25.12 mg/kg[6]；山東省青島市花生、棉花基地土壤DEHP含量最高達20.69 mg/kg[7]；山東省萊州市農(nóng)田土壤中6種PAEs的總含量為4.63～15.59 mg/kg，DEHP含量為12.46～35.77 mg/kg[8]，顯著高于美國密西西比三角洲、丹麥和荷蘭等歐美國家和地區(qū)[9]。DEHP通過土壤進入農(nóng)作物中，楊延杰等[10]研究發(fā)現(xiàn),不同濃度的DEHP對蘿卜種子萌發(fā)和幼苗根系生長呈現(xiàn)低促進高抑制的機制。CHANG等[11]研究發(fā)現(xiàn)DEHP濃度的增加會影響蠶豆植物的DNA多態(tài)性，并對蠶豆苗造成可誘導急性氧化損傷并產(chǎn)生遺傳毒性作用。近年來，PAEs在土壤中的含量和成分[12-14]、在土壤-蔬菜中的遷移[15]、分配[16]、富集[17]、對蔬菜生長的影響[18-19]等方面研究較多，而對于植物對PAEs的耐逆相關功能基因組學研究較少，二代高通量測序方法-轉錄組測序(RNA sequencing,RNA-Seq)技術因其精準度高、成本低，成為探索植物體響應不同脅迫的基因網(wǎng)絡分析的理想工具[20]，本研究利用RNA-Seq技術，對DEHP污染后的蘿卜塊根進行轉錄組測序，分析蘿卜塊根的差異表達基因和代謝通路，探究蘿卜響應DEHP脅迫的分子機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試種子,青島蓉睦善良種有限公司“九斤王”;供試土壤,重慶市潼南區(qū)前進村綠色蔬菜基地。

1.2 試驗方法

1.2.1 盆栽試驗

分別稱取DEHP 50、150和250 mg，溶于丙酮(分析純)，再加入5 kg原始土壤中拌勻，即制得3個污染濃度的土壤DEHP-l(10 mg/kg)、DEHP-m(30 mg/kg)和 DEHP-h(50 mg/kg)，在陰涼通風處放置24 h，以去離子水調(diào)至最大田間持水量的70%，并將其置于溫室內(nèi)平衡15 d，于2019年4月3日播種，2019年6月8日收獲，全生育期為69 d。

1.2.2 透射電鏡觀察

將蘿卜根部組織樣品切成0.1 mm3的小塊，快速放入質量分數(shù)4%的戊二醛中固定，抽真空使樣品下沉，4 ℃下固定24 h，利用0.1 mol/L磷酸緩沖液沖洗3次，用質量分數(shù)1%鋨酸固定4 h，經(jīng)乙醇梯度脫水后用Epon812環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機切片,經(jīng)醋酸雙氧鈾-梓檬酸鉛雙重染色后在透射電鏡下觀察、拍照。

1.2.3 RNA 的提取和Read文庫制備

采用Omega Plant RNA kit 試劑盒法提取蘿卜塊根中的RNA，將經(jīng)不同DEHP濃度處理的蘿卜樣品的總 RNA送廣州基迪奧生物科技有限公司進行Illumina HiSeqTM測序工作。

1.2.4 測序數(shù)據(jù)處理

將原始下機數(shù)據(jù)過濾后獲得的reads比對到參考基因組上，利用Cufflinks組裝得到已知的轉錄本與新的轉錄本，并對得到的基因進行表達量分析與統(tǒng)計，分析差異表達基因(differentially expressed genes, DEGs)和功能富集途徑。

1.2.5 樣本間差異表達基因篩選

使用edgeR軟件對其進行DEGs分析，篩選出不同處理樣品之間的DEGs，并對其顯著性水平(P<0.05)進行分析，將未受污染的蘿卜作為對照組(CK)，計算出不同濃度DEHP污染下的上調(diào)基因數(shù)(Log2ratio>2)和下調(diào)基因數(shù)(Log2ratio<2)。上調(diào)基因表明在DEHP脅迫下基因表達量大于對照組，或某些不表達的基因在DEHP脅迫下開始表達，說明這部分基因多與DEHP脅迫的耐性有關。下調(diào)基因表明在DEHP脅迫下基因表達量小于對照組，說明DEHP脅迫對植物的系統(tǒng)造成了傷害，使得活性下降，表達量降低，大多與生理功能相關。

1.2.6 基因本體(Gene Ontology，GO)功能注釋與分析

以P≤0.05 為閾值，將篩選到的DEGs利用GO seq軟件[21]進行GO富集分析，滿足此條件的GO term 為顯著富集的GO term，并以此來確定差異表達基因所行使的主要生物學功能。本試驗通過研究DEGs在 GO中的分布狀況，了解不同濃度DEHP污染處理下各蘿卜樣本在基因功能層面上的差異。

1.2.7 Pathway途徑分析

利用R語言軟件，篩選條件以Q值≤0.05 為閾值，滿足此條件為在DEGs中顯著富集的pathway，并在京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)中進行注釋[22-23]，通過KEGG 代謝途徑顯著性富集分析來確定DEGs參與的相關信號轉導和生化代謝途徑。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Excel 2013進行數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計分析和繪圖，利用 t-檢驗分析各污染濃度蘿卜的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 DEHP脅迫對蘿卜塊根超微結構的影響

細胞壁作為植物的特有結構，有維持細胞形狀、運輸物質和傳遞信息的作用，也是外界物質進入細胞內(nèi)部的第一屏障[24]，由圖1可知，對照組中的蘿卜細胞壁界限清晰，整齊平滑，厚薄均勻；在10 mg/kg DEHP處理下蘿卜細胞壁變厚；在30 mg/kg DEHP處理下蘿卜細胞壁繼續(xù)加厚，厚薄不均，并出現(xiàn)質壁分離的現(xiàn)象，細胞膜和細胞壁之間有深色顆粒沉淀物；在50 mg/kg DEHP處理下蘿卜細胞壁變形嚴重，有斷裂的現(xiàn)象，質壁分離現(xiàn)象加重，并在細胞膜和細胞壁之間有更多的深色顆粒沉積物。

圖1 DEHP對蘿卜根部細胞壁超微結構的影響Fig.1 Effect of DEHP on cell wall ultrastructure of radish

由圖2可知，對照組中的蘿卜線粒體結構清晰，呈圓形或橢圓形，雙層被膜和內(nèi)部嵴結構完整；在10 mg/kg DEHP處理下蘿卜線粒體數(shù)量減少，體膜結構變化不大；在30 mg/kg DEHP處理下蘿卜線粒體數(shù)量進一步減少，出現(xiàn)空泡化，內(nèi)部嵴的數(shù)量變少，嵴突變得模糊；在50 mg/kg DEHP處理下蘿卜線粒體損傷更加嚴重，內(nèi)部嵴斷裂，線粒體變模糊解體。線粒體結構的損傷將會影響植物體三羧酸循環(huán),使細胞呼吸減弱，抑制信號傳遞，還會影響各種酶的活動。

圖2 DEHP對蘿卜根部細胞線粒體超微結構的影響Fig.2 Effect of DEHP on mitochondria ultrastructure of radish

2.2 轉錄組測序結果統(tǒng)計與分析

2.2.1 轉錄組數(shù)據(jù)質量評估

信息分析前對下機數(shù)據(jù)進行質控與過濾，由表1可知，通過對樣品的轉錄組測序，分別獲得50 071 200、52 707 576、47 261 670和48 651 920條Clean Reads，經(jīng)過整理和篩選分析，得到HQ Clean Reads，分別為49 143 966、51 612 986、46 319 318和47 567 124條，各樣本的HQ Clean Reads均有所下降，相對于Clean Reads，篩選后的HQ Clean Reads占98.15%、97.92%、98.01%和97.77%。4個樣品的Q20均大于98%，Q30均大于95%，測得序列的GC含量占47%以上，說明轉錄組測序質量較高，可以進行下一步的數(shù)據(jù)整理和分析。

表1 數(shù)據(jù)信息統(tǒng)計表Table 1 Statistics of RNA-Seq

2.2.2 差異表達基因分析

以P<0.05為篩選條件篩選差異表達基因后作火山圖，由圖3可知：紅色點代表上調(diào)基因，綠色點代表下調(diào)基因，黑點代表非差異基因。在10 mg/kg處理下，與CK相比,產(chǎn)生9 885個差異表達基因，其中上調(diào)差異表達基因5 993個，下調(diào)差異表達基因3 892個；在30 mg/kg處理下，相比CK產(chǎn)生9 385個差異表達基因，其中上調(diào)差異表達基因6 346個，下調(diào)表達基因3 039個，上調(diào)基因數(shù)量大于下調(diào)基因數(shù)量；在50 mg/kg處理下，相比CK產(chǎn)生11 880個顯著差異表達基因，其中上調(diào)差異表達基因7 336個,下調(diào)差異基因4 544個。3個濃度污染下的上調(diào)基因數(shù)量均大于下調(diào)基因數(shù)量。

a-10 mg/kg處理;b-30 mg/kg處理;c-50 mg/kg處理圖3 差異表達基因火山圖Fig.3 Differential expressed gene olcano map

通過維恩圖(圖4)分析，在5 101個差異重疊基因中，有4 858個差異基因表達趨勢一致，243個差異基因表達趨勢不一致，不一致的基因中CK s DEHP-l上調(diào)基因86個， CK s DEHP-m上調(diào)基因129個， CK s DEHP-h上調(diào)基因153個。隨著污染濃度的加大，越來越多的下調(diào)基因變?yōu)樯险{(diào)，說明蘿卜為適應或抵抗DEHP脅迫，讓更多基因參與到應答反應中。CK s DEHP-l中上調(diào)的86個基因主要是與蛋白激酶、脫氫酶、調(diào)節(jié)蛋白、轉錄蛋白、結合蛋白、過氧化物酶、谷胱甘肽等相關的基因[25-29]，這些基因的上調(diào)表達都與蘿卜塊根的抗性相關，說明其可以抵御一定的DEHP脅迫，但隨著污染濃度的增加，86個基因在CK s DEHP-m中有8個基因變?yōu)橄抡{(diào)，在CK s DEHP-h有83個基因變?yōu)橄抡{(diào)，說明隨著污染濃度的增加，DEHP脅迫會對蘿卜造成嚴重傷害，也說明了蘿卜對DEHP的抵御是有限度的。

圖4 差異表達基因維恩圖Fig.4 Differential expressed gene enn diagram

2.2.3 差異表達基因的GO富集分析

研究發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，3個DEHP污染濃度處理后分別有2 280、2 126和2 030個DEGs被GO注釋到生物過程(biological process，BP)、細胞組分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)3個大類別，由圖5可知，在富集最顯著的前40個GO term中，集中在生物進程的GO term有17個，集中在細胞組分的GO term有12個，集中在分子功能的GO term有11個。其中細胞過程、代謝過程、單有機體過程和刺激響應是生物過程大類中最主要富集的通路，細胞成分、細胞區(qū)域和細胞器是細胞組分大類中最主要富集的通路，催化活性和結合是分子功能大類中最主要富集的通路。

1-代謝過程；2-定位；3-生長；4-細胞成分組織或生物發(fā)生；5-生物調(diào)控；6-繁殖；7-免疫系統(tǒng)過程；8-生殖過程；9-節(jié)律過程；10-多細胞組織過程；11-生物粘附；12-多生物過程；13-細胞過程；14-信號系統(tǒng)15-發(fā)展過程；16-單有機體過程；17-刺激響應；18-膜封閉腔；19-細胞連接；20-細胞外基質；21-膜部件；22-細胞成分；23-細胞區(qū)域；24-高分子絡合物；25-膜；26-細胞器；27-細胞器部分；28-細胞外區(qū)；29-細胞外基質成分；30-信號傳感器活動；31-抗氧化活性；32-核酸結合轉錄因子活性；33-轉錄因子活性，蛋白質結合；34-催化活性；35-結構分子活性；36-結合；37-電子載流子活性；38-轉運活性；39-分子功能調(diào)節(jié)劑；40-分子換能器活性圖5 DEHP污染下蘿卜差異表達基因的GO功能分類Fig.5 Gene Ontology functional classification of differentially expressed genes after DEHP treatment

2.3 差異表達基因KEGG富集分析

由表2可知，將KEGG數(shù)據(jù)庫作為參考，與空白對照組相比，10 mg/kg污染濃度下有2 133個DEGs注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫中的129個分類代謝途徑，顯著富集的有20個通路(P<0.05)；30 mg/kg污染濃度下有1 991個DEGs注釋到KEGG 數(shù)據(jù)庫中的130個分類代謝途徑，顯著富集的有22個通路(P<0.05)；50 mg/kg污染濃度下有2 641個DEGs注釋到 KEGG 數(shù)據(jù)庫中的130個分類代謝途徑，顯著富集的有20個通路(P<0.05)。

其中ko00270、ko00591、ko00592、ko00400、ko00260等通路包含的差異基因較多，這些通路主要涉及半胱氨酸與蛋氨酸代謝、亞油酸、α-亞麻酸代謝、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成和甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝等過程。

2.4 蘿卜中半胱氨酸與蛋氨酸代謝的反應

通過KEGG注釋，分別有61、61、78條unigenes被注釋到代謝所在的半胱氨酸與蛋氨酸代謝的KEGG通路，其中支鏈氨基酸轉氨酶(2.6.1.42)、精胺合成酶(2.5.1.16)、1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合成酶(4.4.1.14)和蛋氨酸γ裂解酶(4.4.1.11)在各污染處理組中均上調(diào)；丙氨酸-乙醛酸轉氨酶(2.6.1.44)在10和30 mg/kg處理下，表達基因有上調(diào)，在50 mg/kg處理下表達基因有上調(diào)/下調(diào)的趨勢；胞嘧啶-5-甲基轉移酶(2.1.1.37)和硫代硫酸鹽/3-巰基丙酮酸硫轉移酶(2.8.1.2)在各污染處理組中均下調(diào)。其中精胺合成酶(spermine synthase,SPMS)、丙氨酸乙醛酸轉氨酶與抵御外部環(huán)境脅迫相關[30-31]，胞嘧啶-5-甲基轉移酶與植物生長發(fā)育相關[32]。

光呼吸是光合作用的補充反應，當受到外界脅迫時，植物會通過光呼吸消耗體內(nèi)的乙醛酸，降低對細胞的傷害，提高植物抗病性和抗逆性[33-34]。光呼吸代謝時，轉氨酶作為氨基酸代謝中重要的催化劑促成乙醛酸的轉氨反應，有研究表明丙氨酸-乙醛酸轉氨酶(alanine-glyoxylate transaminase，GAT)定位于線粒體中，與乙醛酸代謝途徑相關并參與了光呼吸途徑，小麥在低溫、脫落酸、干旱和高鹽處理下GAT的表達量均隨脅迫的加大呈拋物線變化[35]。本試驗中隨著DEHP污染濃度的增加，蘿卜塊根上調(diào)GAT來加大光呼吸作用，抵御DEHP脅迫，但當濃度增加到50 mg/kg時，線粒體受到嚴重損傷甚至解體，導致GAT下降,影響蘿卜耐受性，這與透射電鏡中觀察到線粒體的變化一致。

多胺(polyamines，PAs)作為一種低分子量脂肪族的含氮堿廣泛存在于生物體中，有研究表明植物中的多胺作為可溶性物質、核苷酸和細胞膜的保護物質、活性氧清除劑等來參與細胞的抗逆過程，抵御外部環(huán)境脅迫[6,37]。SPMS在多胺合成后期將腐胺催化合成精胺，WI等[38]研究發(fā)現(xiàn)多胺含量的增加可以提高馬鈴薯耐非生物脅迫的能力，TANOU等[39]研究發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫下柑桔通過上調(diào)PAs表達量改變其氧化狀態(tài)。本試驗中在DEHP脅迫下蘿卜中SPMS表達量增加，且中高濃度污染下參與基因多于低濃度污染，表明蘿卜可通過調(diào)節(jié)多胺含量提高逆境抗性。

DNA甲基化是生物基因組中普遍的共價修飾方式，參與了基因的表達調(diào)控、胚胎發(fā)育、細胞分化、基因組印跡、X染色體失活等，甲基化水平不足將會影響植物生長發(fā)育，胞嘧啶-5-甲基轉移酶(DNA (cytosine-5)-methyltransferase，5-MeC METI)可以識別特異DNA堿基序列并催化其進行甲基化修飾。大量研究表明,在溫度、化學試劑、金屬等脅迫下會引起植物DNA甲基化狀態(tài)和程度的變化[40-42]，F(xiàn)INNEGAN等[43]在煙草中轉入甲基轉移酶反義基因MET1，發(fā)現(xiàn)其DNA甲基化水平下降，進而影響植株開花時間、生殖能力和花葉形態(tài)。本試驗中發(fā)現(xiàn)各污染組DEHP脅迫下5-MeC METI表達量均下調(diào)，使得DNA甲基化水平下降，同時METI表達量的下調(diào)會間接影響纖維素合成酶的表達進而導致纖維素合成下降[44]，在透射電鏡觀察中，蘿卜塊根細胞壁隨污染濃度的增加而變形甚至斷裂，降低了細胞抵御外界脅迫的能力。

表2 DEHP差異表達基因的 KEGG 富集分析Table 2 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes under DEHP pollution

續(xù)表2

2.5 蘿卜中α-亞麻酸代謝的反應

通過KEGG注釋，各DEHP污染處理組分別有25、23、27條unigenes被注釋到代謝所在的α-亞麻酸代謝的KEGG通路，脂氫過氧化物裂解酶(HPL1)表達基因在各污染處理組中均下調(diào)；乙酰輔酶A?；D移酶(2.3.1.16)在10和30 mg/kg處理下，表達基因均有上調(diào)/下調(diào)的趨勢，在50 mg/kg處理下表達基因全部變?yōu)樯险{(diào)；12-氧-植物二烯酸還原酶(1.3.1.42)在10 mg/kg處理下表達基因上調(diào)，在30和50 mg/kg處理下，表達基因有上調(diào)/下調(diào)的趨勢。其中脂氫過氧化物裂解酶、乙酰輔酶A?；D移酶和12-氧-植物二烯酸還原酶均與蘿卜生長發(fā)育和品質有關。

植物在脂氧化過程中通過脂氫過氧化物裂解酶(hydroperoxide lyase，HPL)催化脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)的反應產(chǎn)物脂氫過氧化物(HPOD或HPOT)裂解生成短鏈醛和含氧酸[45]，HPL裂解產(chǎn)物不僅可以揮發(fā)出植物特殊的芬芳氣味，還參與植物抗病蟲、抗傷害和抗逆的防御響應。有研究表明HPL的催化反應與脂類代謝系統(tǒng)密切相關，其活性會被脂類物質的抗氧化劑所抑制，同時HPL活性基團中的Fe3+還能與脂氫過氧化物作用形成烷氧基和鐵羥絡合物，說明金屬螯合劑也能抑制其催化活性[46]。在DEHP的脅迫下，蘿卜中脂代謝活動加強，抑制了HPL活性，導致其基因表達下調(diào)，同時降低了特異氣味形成，影響蘿卜質量。

乙酰輔酶A?；D移酶(acetyl-CoA C-acetyltransferase，AACT)是甲羥戊酸(me alonate，M A)合成的重要酶類，通過催化蛋白質的?；腿ヵ；瘉硇揎椫参锏鞍踪|，調(diào)節(jié)蛋白質生物活性和基因表達，調(diào)控植物的生長發(fā)育及主要活性成分的合成[47]。本試驗中AACT表達量的變化說明DEHP脅迫誘發(fā)了蘿卜的防御反應，與低中濃度相比，高濃度處理后AACT表達量增加，加快了M A的合成，并通過M A來抵御DEHP脅迫。

茉莉酸類化合物是植物體內(nèi)產(chǎn)生的天然植物激素,包括茉莉酸、茉莉酸甲酯及茉莉酸衍生物[48]，在植物受到外界脅迫時作為信號分子調(diào)控下游相關基因的表達水平，宋云等[49]研究發(fā)現(xiàn)茉莉酸不僅可以調(diào)控植物生長發(fā)育，還在植物受到機械傷害、病蟲害等脅迫下作出防御響應。12-氧-植物二烯酸還原酶(12-oxophytodienoic acid reductase，OPR)是茉莉酸生物合成(十八烷碳烯酸代謝途徑)的正調(diào)控因子，有研究表明植物中的OPR在各種生物和非生物脅迫下具有特異性表達模式，小麥在受鹽脅迫時OPR1基因(TaOPR1)上調(diào)表達以響應各種刺激因子，而OPR2基因(TaOPR2)則因高鹽處理表達受到抑制[50]。香蕉中12-氧-植物二烯酸還原酶(MaOPR)在乙烯、枯萎病脅迫下表達上調(diào)以響應脅迫，特別在莖和果實中表達量較高[51]。本試驗中發(fā)現(xiàn)蘿卜的OPR在低濃度污染時表達基因上調(diào)，說明蘿卜通過激活茉莉酸信號抵御外來脅迫，但隨著污染濃度增加，OPR的部分表達基因變?yōu)橄抡{(diào)，也說明蘿卜抵御脅迫的能力是有限度的。

2.6 蘿卜中亞油酸的反應

通過KEGG注釋，各DEHP污染處理組分別有11、10、15條unigenes被注釋到代謝所在的亞油酸的KEGG通路，各DEHP污染處理組中，LOX(1.13.11.12)在10 mg/kg處理下，表達基因下調(diào)，30和50 mg/kg處理下，表達基因有上調(diào)/下調(diào)的趨勢。在各處理組的分泌型磷脂酶A2(3.1.1.4)表達基因均上調(diào)，亞油酸9S脂氧合酶(1.13.11.58)表達基因均有上調(diào)/下調(diào)的趨勢。其中LOX、分泌型磷脂酶A2均與抵御外部環(huán)境脅迫相關。

LOX能催化植物體內(nèi)酚基甘油酯產(chǎn)生脂肪酸衍生物，是植物脂肪酸氧化的一條重要途徑，一般在逆境條件下啟動，與植物種子的萌發(fā)與老化、生長發(fā)育進程、抗逆境脅迫和特有風味物質的產(chǎn)生密切相關[52]。植物發(fā)生超敏(hypersensiti e response，HR)反應時，細胞膜崩裂、電解質滲漏、細胞降解，細胞膜系統(tǒng)的破壞可能主要源于膜脂的過氧化反應，LOX是植物體內(nèi)膜脂過氧化反應中的重要酶類，其在催化不飽和脂肪酸生成氫過氧化物脂肪酸的同時，產(chǎn)生大量的活性氧，后者參與細胞膜脂的過氧化，破壞細胞膜，導致細胞壞死。有研究表明,用放線菌酮抑制LOX的誘導后，也抑制了HR反應。同時，LOX還能催化植物防衛(wèi)反應信號分子的合成，通過脂氧合酶途徑合成的茉莉酸甲酯、茉莉酸酮酸和7-異茉莉酸都可激活植物的防衛(wèi)基因[53]。在DEHP的污染下，各處理組的LOX均有下調(diào)，表明蘿卜通過降低LOX來應對DEHP的脅迫，但中高污染濃度下LOX部分上調(diào)，產(chǎn)生活性氧，導致蘿卜防衛(wèi)基因下調(diào)和細胞膜破損，所以隨著污染濃度增加，蘿卜塊根細胞壁開始變形甚至斷裂，并出現(xiàn)質壁分離。

磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)作為一類能水解磷脂甘油C-2酯鍵生成游離脂肪酸以及溶血磷脂的酶類廣泛存在于植物組織中，在細胞磷脂消化、新陳代謝、信號轉導以及宿主防御等生理過程中起重要作用。有研究表明PLA2表達調(diào)節(jié)與傷害[54]和病原侵染[55]時的信號傳導有關； CHAPMAN[56]研究發(fā)現(xiàn)，植物PLA2會在受傷或逆境時被激活，且表達量顯著增加；YOUNG等[57]發(fā)現(xiàn)在水稻黃單胞菌脅迫下，體內(nèi)磷脂代謝活動加強，PLA2活性的積累還可以迅速增加植物體內(nèi)茉莉酸含量，對DEHP脅迫作出防御響應，但PLA2的活化也會導致質膜的破壞，這與透射電鏡觀測結果一致。

3 結論

本研究以蘿卜為研究對象，探究了不同濃度DEHP污染下蘿卜與空白組的亞顯微結構和轉錄組的差異。亞顯微結構研究表明，DEHP脅迫會破壞蘿卜塊根細胞的結構，導致細胞壁加厚變形、部分斷裂，線粒體嵴數(shù)減少，內(nèi)部嵴斷裂變模糊甚至解體，且污染濃度越大，破壞越嚴重。應答轉錄組分析研究表明，通過過轉錄組測序，分別獲得9 885、9 385和11 880條顯著差異表達基因，且上調(diào)基因數(shù)量均大于下調(diào)基因數(shù)量。通過GO數(shù)據(jù)注釋發(fā)現(xiàn)，差異表達基因在GO中參與最多的生物過程是細胞過程、代謝過程、單有機體過程和刺激響應，參與最多的細胞組分是細胞成分、細胞區(qū)域和細胞器，參與最多的分子功能是催化活性和結合。KEGG富集分析得出，3組不同污染濃度下共同富集最多的主要通路是苯丙氨酸代謝、亞油酸、α-亞麻酸代謝、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、苯丙酸生物合成、類胡蘿卜素生物合成、半胱氨酸與蛋氨酸代謝。通過比較空白組和DEHP脅迫組的差異基因發(fā)現(xiàn)半胱氨酸與蛋氨酸代謝、亞油酸、α-亞麻酸代謝的差異基因富集比例較高，說明蘿卜在DEHP脅迫下通過這些通路來表達應激反應，值得進一步研究相關基因的應激機制。半胱氨酸與蛋氨酸代謝途徑中的GAT、PAs和5-MeC METI，油酸代謝途徑中的LOX和PLA2，α-亞麻酸代謝途徑中的HPL、AACT和OPR均對DEHP脅迫表現(xiàn)出抗性，說明顯著差異基因對蘿卜的非生物脅迫的響應具有重要意義。