杜 藝 梁 順 魏玉婷 柯劍婷 裴雪峰

1.中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東珠海 519000；2.廣東省粵北人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣東韶關(guān) 512000

阻塞型睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS）是指在睡眠狀態(tài)下上氣道塌陷阻塞所致的呼吸反復(fù)暫停或低通氣，伴有呼吸中樞神經(jīng)調(diào)節(jié)因素障礙的疾病[1]。OSAHS是臨床常見(jiàn)疾病之一，中年人患病率為2%～4%，兒童為2%～4.8%[2]，同時(shí)OSAHS 是高血壓與冠心病等常見(jiàn)心腦血管疾病的重要致病因素[3]。慢性間歇性缺氧（chronic intermittent hypoxia，CIH）是造成OSAHS患者器官損害的機(jī)制之一[4]，近年來(lái)對(duì)OSAHS相關(guān)的腎損傷研究也愈來(lái)愈重視。既往對(duì)OSAHS的治療研究重點(diǎn)多集中在外科手術(shù)，近年來(lái)對(duì)于內(nèi)科藥物的輔助治療也愈加深入。本研究通過(guò)模擬CIH 致腎損傷大鼠，采用別嘌呤醇（allopurinol，ALLO）對(duì)其進(jìn)行干預(yù)，觀察ALLO 對(duì)CIH 大鼠腎臟損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

ALLO（上海信誼萬(wàn)象藥業(yè)股份有限公司），蛋白濃度測(cè)定試劑盒（Thomo公司，美國(guó)），Western 及IP 裂解液、PMSF （南京建成生物工程研究所），β-actin抗體（Sigma公司，美國(guó)），黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）抗體（山羊多克隆抗體，Santa公司，美國(guó)），HRP-IgG（CST公司，美國(guó)），ECL 發(fā)光液（北京酷來(lái)搏科技有限公司）。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）Assay 試劑盒（南京建成生物工程研究所），ELISA 試劑盒（購(gòu)于上海銘睿生物科技有限公司），慢性間歇性缺氧/再氧合動(dòng)物艙（廣州市華粵儀器有限公司）。

1.2 建立動(dòng)物模型

健康雄性Wistar 大鼠40只，8周齡，體重180～200 g，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，自由飲水飲食，飼養(yǎng)環(huán)境溫度19～23℃，空氣濕度為50%～60%。采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為正常對(duì)照組（10只）、模型組（30只），模型組又隨機(jī)分為模型對(duì)照組、ALLO小劑量組、ALLO大劑量組，各10只。

在大鼠適應(yīng)期后，ALLO分別按40 mg/（kg·d）、20 mg/（kg·d）溶于2 ml 生理鹽水?dāng)嚢杈鶆蚝蠊辔?；模型?duì)照組生理鹽水同等劑量灌胃，同時(shí)開(kāi)始CIH模型建立。建模方法：根據(jù)N2稀釋原理，循環(huán)充入N2和O2，每1個(gè)循環(huán)為9 min，4 min 充入N2，隨之5 min 充入O2，使箱內(nèi)氧濃度在6%和21%切換；由測(cè)氧儀監(jiān)測(cè)間歇性低氧艙中的氧濃度，調(diào)節(jié)氣體流量，使每1個(gè)循環(huán)間歇性低氧艙內(nèi)的最低氧濃度達(dá)6%左右，持續(xù)45 s 左右，然后再逐漸恢復(fù)至21%。艙內(nèi)N2和O2的轉(zhuǎn)換通過(guò)定時(shí)電磁轉(zhuǎn)換器完成，該循環(huán)每天重復(fù)8 h，共14 d，最終建立間歇性低氧大鼠模型[5-6]。每天上午8點(diǎn)至下午4點(diǎn)將模型組放置于間歇性缺氧艙內(nèi)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中將整個(gè)實(shí)驗(yàn)艙罩上黑布，模擬夜晚大鼠睡眠環(huán)境，實(shí)驗(yàn)艙內(nèi)及室內(nèi)溫度20～25℃，濕度45%～55%；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，所有大鼠均放置普通飼養(yǎng)籠中飼養(yǎng)且給予人工日光照射，模擬大鼠白天狀態(tài)，大鼠全天活動(dòng)及飲食自由。對(duì)照組大鼠放置無(wú)蓋箱內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)，不予任何處理。每天除實(shí)驗(yàn)時(shí)間外，所有大鼠放置相同自然環(huán)境下生活和飼養(yǎng)。

1.3 標(biāo)本獲取及檢測(cè)

1.3.1 血清標(biāo)本獲取 造模且治療14 d后，所有大鼠尾靜脈采血，分離血清待測(cè)。ELISA 方法檢測(cè)血清血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），放射免疫法測(cè)定胱抑素C（cystatin C，Cys-C）。

1.3.2 腎組織標(biāo)本獲取 10%水合氯醛麻醉大鼠，開(kāi)腹暴露左右腎，行腎靜脈注射PBS 液洗至腎蒼白再將腎取出，取100 mg 腎皮質(zhì)，加入1 ml 生理鹽水后研磨成10%的勻漿，3000 r/min，離心10 min，取上清液應(yīng)用比色檢測(cè)試劑盒檢測(cè)DOD、MDA水平，具體試驗(yàn)方法見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

1.3.3 病理切片制作 4%多聚甲醛固定部分腎組織24 h后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，制備4 μm石蠟切片。常規(guī)HE 染色，中性樹(shù)脂封片，光鏡顯微鏡（×400）下觀察分析腎臟組織病理變化。

1.3.4 Western blot 檢測(cè)XO表達(dá) 以蛋白提取液裂解組織30 min，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，加5×Buffer蛋白上樣緩沖液煮沸10 min，使蛋白變性。各孔道上樣50 μg 10% SDS-PAGE 凝膠，恒壓電泳，后濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜。5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗（XO 多克隆抗體1∶600），4℃孵育過(guò)夜，β-actin（1∶200）作為內(nèi)參，TBST 洗膜3次。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗（濃度1∶5000）室溫孵育1 h，TBST 洗膜3次，ECL 發(fā)光液暗室膠片曝光。以β-actin 為內(nèi)參，Quantity One 4.6.2 圖像分析軟件采集分析結(jié)果，計(jì)算XO 與β-actin 灰度比值作為相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析處理數(shù)據(jù)，服從正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，正態(tài)分布且組間方差齊性采用方差分析，兩兩比較采用t 檢驗(yàn)，采用Pearson 檢測(cè)進(jìn)行相關(guān)性分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎組織切片光鏡觀察

正常對(duì)照組腎小球、腎小管及腎小管間質(zhì)未發(fā)現(xiàn)異常（圖1A）。模型對(duì)照組腎組織切片可見(jiàn)腎小球體積增大、系膜細(xì)胞和基質(zhì)顯著增生，可見(jiàn)部分腎小球出現(xiàn)局灶性節(jié)段性硬化；腎小管局灶性片狀擴(kuò)張，上皮細(xì)胞可見(jiàn)空泡樣變性（圖1B）。ALLO小劑量組、ALLO大劑量組的腎小球肥大較模型組明顯減輕，無(wú)腎小球硬化；上皮細(xì)胞空泡樣變性消失（圖1C、圖1D）。

圖1 腎組織切片光鏡圖（HE，400×）

2.2 各組血Cys-C、VEGF水平及腎組織SOD、MDA、XO水平表達(dá)的比較

模型對(duì)照組的血Cys-C、VEGF水平，腎組織MDA及XO表達(dá)水平高于正常對(duì)照組，腎組織SOD水平低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；模型對(duì)照組的血Cys-C、VEGF水平高于ALLO組，腎組織MDA、XO表達(dá)水平高于ALLO組，腎組織SOD表達(dá)水平低于ALLO組（P＜0.01）；ALLO大劑量組的腎組織MDA水平低于模型對(duì)照組、ALLO小劑量組，SOD水平高于模型對(duì)照組及ALLO小劑量組（P＜0.05）。ALLO大劑量組與ALLO小劑量組的血Cys-C、VEGF水平及腎組織XO表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

表1 各組血Cys-C、VEGF水平、腎組織SOD、MDA水平、XO表達(dá)的比較（±s）

表1 各組血Cys-C、VEGF水平、腎組織SOD、MDA水平、XO表達(dá)的比較（±s）

與正常對(duì)照組比較，*P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，#P＜0.01；與ALLO小劑量組比較，☆P＜0.05

組別 只數(shù) Cys-C（pmol/L） VEGF（pg/ml） SOD（μmol/L） MDA（μmol/L） XO正常對(duì)照組模型對(duì)照組ALLO小劑量組ALLO大劑量組10 10 10 10 59.8±25.5 101.3±29.1*82.6±26.7*#73.9±25.4*#52.14±5.68 190.5±15.3*86.3±7.5*#81.2±8.4*#101.25±1.26 52.3±1.02*88.3±1.11*#111.5±1.34#☆5.09±1.24 33.6±5.32*21.5±3.32*#10.2±2.01*#☆0.29±0.09 0.92±0.12*0.52±0.19*#0.61±0.17*#

2.3 腎組織MDA水平與血VGEF 的相關(guān)性

Pearson分析結(jié)果顯示，腎組織MDA水平與血VGEF 有相關(guān)性（r=0.65，P＜0.05）。

3 討論

OSAHS 主要表現(xiàn)為睡眠中出現(xiàn)完全或不完全的上氣道阻塞或塌陷，導(dǎo)致短暫呼吸停止或明顯低通氣在睡眠過(guò)程中反復(fù)發(fā)生，進(jìn)而引起夜間低氧血癥、二氧化碳潴留與睡眠結(jié)構(gòu)片段化等，漸進(jìn)性地對(duì)人體各臟器產(chǎn)生損害[7]，主要變現(xiàn)為高血壓病、高脂血癥、高胰島素抵抗、肥胖、糖耐量異常、視神經(jīng)非動(dòng)脈炎性病變、心肌梗死、心力衰竭、哮喘和腦梗死等[8]。國(guó)內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn)，OSAHS 通過(guò)CIH 導(dǎo)致交感神經(jīng)的異常興奮、內(nèi)皮功能的紊亂、氧化應(yīng)激反應(yīng)等引起腎臟功能損害[9]，集中表現(xiàn)為腎功能改變、蛋白尿、多尿以及小管功能受損等[10]。持續(xù)氣道正壓（continuous positive airway pressure，CPAP）即用面罩將持續(xù)的正壓氣流送入氣道，作為一種標(biāo)準(zhǔn)的無(wú)創(chuàng)治療方式，其仍然是OSAHS患者的首選，對(duì)患者的腎臟功能損傷也具有明顯的改善作用。但有關(guān)報(bào)道顯示，在CPAP治療過(guò)程中有一定比例的患者不能耐受、依存性差，舒適度不夠，而且費(fèi)用較高，長(zhǎng)期使用者僅占40%[11-12]。因此，對(duì)藥物減輕OSAHS 臟器功能損害的研究近年來(lái)就越來(lái)越受到重視。

ALLO 為XO 抑制劑，XO 在嘌呤新陳代謝中扮演重要角色，且是活性氧（reactive oxygen species，ROS）的主要內(nèi)源性來(lái)源[13]，在缺氧狀態(tài)下其含量將會(huì)上升，從而引起氧化應(yīng)激。ALLO 抑制XO 活性可以減少氧化應(yīng)激，防止氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷以及缺血性并發(fā)癥得到驗(yàn)證。ALLO 能改善大動(dòng)脈的順應(yīng)性及內(nèi)皮細(xì)胞功能，減輕動(dòng)脈硬化而不依賴于尿酸的降低[14]。一項(xiàng)來(lái)自英國(guó)的觀察性研究顯示，ALLO 治療是改善慢性腎臟病患者動(dòng)脈硬化的獨(dú)立決定因素，并且有效地降低了外周血壓、中心血壓[15]。在慢性心力衰竭持續(xù)性缺氧時(shí)有報(bào)道ALLO 可以緩解XO 蛋白表達(dá)和活性均上調(diào)，減輕心臟和血管的氧化應(yīng)激[16]。Hirsch等[17]報(bào)道，心力衰竭患者靜脈輸入ALLO后高能磷酸鹽相對(duì)和絕對(duì)濃度均升高，增加了心力衰竭患者ATP的生成。ALLO 對(duì)慢性心力衰竭大鼠心功能的改善作用基于其在慢性心力衰竭持續(xù)性缺氧患者中的治療作用，本研究通過(guò)建立CIH 大鼠模型，觀察ALLO 處理后CIH 大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)及腎功的變化、ALLO是否對(duì)OSAHS所致的CIH 狀態(tài)的血管內(nèi)皮功能有益，以期對(duì)臨床OSAHS的藥物治療提供線索。

本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)間歇性缺氧處理后，模型對(duì)照組的血CysC 水平及腎組織的HE 染色均顯示明確的腎臟受損，腎組織中SOD水平下降，MDA水平、XO表達(dá)上升，提示在CIH 下腎組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)加重，XO 在缺氧狀態(tài)下其含量將會(huì)上升，XO表達(dá)加強(qiáng)產(chǎn)生ROS 可以使腎組織細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，產(chǎn)生毒性終產(chǎn)物MDA[18]，從而引起氧化應(yīng)激，這與既往的研究結(jié)果（OSAHS患者體內(nèi)存在氧化應(yīng)激和抗氧化能力下降[19]引起腎臟組織的損傷）符合。本實(shí)驗(yàn)中，模型對(duì)照組大鼠出現(xiàn)明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)伴腎損傷，同時(shí)有VEGF水平的上升。VEGF 是體內(nèi)廣泛存在的一種調(diào)節(jié)性蛋白質(zhì)，高度特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖、細(xì)胞質(zhì)鈣聚集以及血管生成的作用，在肺、腎臟、肝臟、腦和脾臟中含量豐富[20]。在腎臟中，VEGF 主要表達(dá)在腎小球足細(xì)胞，遠(yuǎn)曲小管和集合管也有少量表達(dá)在近曲小管[21]。缺血缺氧是VEGF表達(dá)水平升高的強(qiáng)烈誘導(dǎo)因素[22]，模型對(duì)照組大鼠明顯的VEGF 上升說(shuō)明CIH時(shí)出現(xiàn)血管內(nèi)皮的損傷，VEGF 與腎小球基底膜有高度的親和力，能使基底膜的通透性增加，并促進(jìn)一氧化氮、內(nèi)皮素的產(chǎn)生，從而改變腎臟的血流動(dòng)力學(xué)，導(dǎo)致蛋白尿的產(chǎn)生，損害腎功能[23]。文獻(xiàn)證實(shí)，ALLO 這種抗氧化劑對(duì)中重度OSAHS患者內(nèi)皮細(xì)胞損傷有改善的作用，與本實(shí)驗(yàn)相符[24]，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)MDA水平與VGEF 有相關(guān)性（r=0.65，P＜0.05）。

本實(shí)驗(yàn)中，ALLO兩組大鼠給予不同劑量的ALLO 干預(yù)后與模型對(duì)照組比較，血VEGF水平減低，腎組織中SOD水平上升，MDA水平下降，XO 的表達(dá)減少進(jìn)而腎損傷減輕。但ALLO大劑量組和ALLO小劑量組只在腎組織MDA、SOD水平方面有差異，在血VGEF水平和XO 的表達(dá)方面并未發(fā)現(xiàn)顯著性差異，提示ALLO 對(duì)CIH 大鼠的氧化應(yīng)激有抑制作用，同時(shí)可以降低血VGEF水平，但增大別嘌醇的劑量對(duì)XO的表達(dá)、血VGEF水平并未發(fā)揮作用。

因此，ALLO 對(duì)CIH 大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)有抑制作用且隨劑量的加大作用更加顯著，同時(shí)ALLO 對(duì)CIH 大鼠的血VGEF水平有抑制作用，ALLO 可以減輕CIH 大鼠的腎損傷，CIH 大鼠的腎損傷可能與氧化應(yīng)激及VGEF 有關(guān)，ALLO 可以作為OSAHS 腎損傷治療藥物的一個(gè)選擇做進(jìn)一步的研究。