唐曉偉 晏銳銳 胥晶

摘 要：建立糕點(diǎn)中5種常用合成著色劑的高效液相色譜法檢測(cè)方法。以乙醇∶乙腈=2∶1混合溶液為提取液，旋蒸后過柱凈化，以初始流動(dòng)相定容，上機(jī)檢測(cè)。以0.02 mol/L乙酸銨-乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，采用C18反相色譜柱，紫外檢測(cè)器檢測(cè)?；厥章试?0%～105%，檢出限為2～3 mg/kg，該方法可用于糕點(diǎn)中合成著色劑的日常檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：合成著色劑;糕點(diǎn);高效液相色譜

糕點(diǎn)是生活中不可缺少的主要休閑食品，因其香甜的口感、別致的外形受到人們尤其是小朋友的喜愛。2019年，全國(guó)糕點(diǎn)行業(yè)收入3 800億元，其中針對(duì)幼年群體的產(chǎn)品份額達(dá)到1 344億元，總比達(dá)到35.4%。隨著糕點(diǎn)行業(yè)的快速發(fā)展，一些商家為了在外觀口感上出新，追求靚麗的造型，人為加入某些人工合成著色劑。與天然色素相比，人工合成類著色劑具有價(jià)格低廉、性質(zhì)穩(wěn)定、色彩艷麗等優(yōu)點(diǎn)。然而，合成類著色劑多以石油化工產(chǎn)品為原料，經(jīng)過磺化、硝化等反應(yīng)后得到的[1]，本身帶有一定的毒性。長(zhǎng)期超量食用，會(huì)影響兒童神經(jīng)系統(tǒng)及骨骼的發(fā)育。目前，合成類著色劑的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)為GB 5009.35-2016。該標(biāo)準(zhǔn)樣品范圍并未包含糕點(diǎn)[2]，且國(guó)家對(duì)糕點(diǎn)類人工著色劑的使用限量未做明確要求。本文以

GB 5009.36-2016為參考，對(duì)糕點(diǎn)中常用的檸檬黃等5種合成著色劑建立液相色譜法檢測(cè)方法，已取得滿意結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

樣品采用蜜餞類糕點(diǎn)，該糕點(diǎn)基質(zhì)復(fù)雜，油脂、蛋白質(zhì)、淀粉含量較高。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀（島津LC-30A，配紫外檢測(cè)器），電子天平（0.001 g，賽多利斯），高速離心機(jī)。

1.3 試劑耗材

檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅與日落黃5種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（海岸鴻蒙，濃度均為1 000 mg/L），乙酸銨（優(yōu)級(jí)純），磷酸氫二胺（優(yōu)級(jí)純），乙酸鋅（優(yōu)級(jí)純），亞鐵氰化鉀（優(yōu)級(jí)純），甲醇（色譜純），乙腈（色譜純），聚酰胺固相萃取柱（dikma，150 mg/6 mL）。

1.4 儀器條件

檢測(cè)波長(zhǎng)430、483、510 nm，流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，梯度洗脫程序見表1。

8 000 r/min離心5 min，放置冰箱冷藏60 min，移取提取液5 mL，在40 ℃水浴條件下氮吹近干，加入3 mL甲醇溶解待用。

2.2 過柱步驟

活化：依次用5 mL甲醇、5 mL

10%甲酸水活化;上樣：加入待凈化液，棄去流出液;淋洗：加入5 mL甲醇，棄去流出液;洗脫：加入15%氨水甲醇溶液，收集流出液，在40 ℃條件下氮吹至干，用初始流動(dòng)相定容至

1 mL，供分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

用超純水將5種合成著色劑分別配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，經(jīng)液相色譜儀進(jìn)樣檢測(cè)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到5種合成著色劑的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線;以3倍噪聲比確定最低檢出限。回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表2。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)光譜圖（圖1）得，5種著色劑的最佳檢測(cè)波長(zhǎng)為：檸檬黃428 nm、莧菜紅521 nm、胭脂紅509 nm、誘惑紅509 nm以及日落黃483 nm。為方便識(shí)別與計(jì)算，在實(shí)際檢測(cè)過程中采用如下波長(zhǎng)：檸檬黃430 nm、莧菜紅胭脂紅誘惑紅510 nm、日落黃483 nm進(jìn)行

檢測(cè)。

3.3 流動(dòng)相的選擇

本次研究采用了（a）0.02 mol/L乙酸銨-甲醇、（b）0.05 mol/L磷酸氫二銨-甲醇、（c）0.05 mol/L磷酸氫二銨-乙腈、（d）0.02 mol/L乙酸銨-乙腈流動(dòng)相體系。結(jié)果表明，b、c體系中檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅不能出峰，日落黃、誘惑紅出峰但響應(yīng)很低。a、d體系中5種目標(biāo)物均能完全出峰，響應(yīng)值良好。但是在a體系中胭脂紅、日落黃、誘惑紅響應(yīng)時(shí)間間隔較近，易受到雜峰干擾。對(duì)于極性物質(zhì)乙腈的溶解洗脫能力比甲醇強(qiáng)，且在實(shí)際進(jìn)樣過程中乙腈體系柱壓比甲醇體系小15%，對(duì)色譜柱損耗較小，因此采用0.02 mol/L乙酸銨-乙腈體系進(jìn)行洗脫。

3.4 流動(dòng)相梯度選擇

研究中試用了等度和梯度兩種洗脫程序。在等度洗脫中，壓力穩(wěn)定，基線平衡性好，但是胭脂紅、日落黃、誘惑紅3個(gè)目標(biāo)峰出現(xiàn)了連峰情況。此外，5個(gè)目標(biāo)峰出峰時(shí)間較長(zhǎng)，完成進(jìn)樣需要27 min。在梯度洗脫中，5個(gè)目標(biāo)峰峰形良好且彼此獨(dú)立。流動(dòng)相濃度的變化會(huì)引起基線漂移，但不影響定量計(jì)算，在可接受范圍內(nèi)。經(jīng)過優(yōu)化，確定了2.4中的洗脫程序，進(jìn)樣時(shí)間共計(jì)15 min。

3.5 凈化條件的選擇

糕點(diǎn)中主要的干擾物質(zhì)為脂肪、蛋白質(zhì)及淀粉等，首先采用沉淀劑凈化的方法。在研究中試驗(yàn)了常用的3種沉淀劑：①乙酸鋅-亞鐵氰化鉀;②15%三氯乙酸[3];③硫酸鋅-氫氧化鈉。沉淀離心后，取上清液過柱定容，上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果表明，②體系僅對(duì)蛋白質(zhì)有沉淀作用，對(duì)淀粉類物質(zhì)無凈化作用，處理后樣液渾濁，雜質(zhì)較多，不能進(jìn)行上機(jī)分析的操作。①和③體系對(duì)樣品凈化作用較好，樣液澄清。但回收率較低，尤其是檸檬黃和莧菜紅，回收率不到30%。兩種體系均是利用鹽析反應(yīng)使蛋白質(zhì)變性沉淀，在此過程中鹽對(duì)目標(biāo)物可能具有吸附作用。在兩種體系樣品離心后產(chǎn)生的沉淀中，均發(fā)現(xiàn)帶有目標(biāo)物。因此沉淀劑凈化方法不適用。

乙醇具有能使蛋白質(zhì)變性沉淀的特點(diǎn)，同時(shí)淀粉、脂肪不溶于乙醇和乙腈。經(jīng)過多次改良，最終確定乙醇∶乙腈=2∶1作為樣品提取液，濃縮后過柱凈化的處理方法。

4 目標(biāo)物回收率

本次試驗(yàn)采用三水平六平行的加標(biāo)驗(yàn)證模式。3組加標(biāo)濃度5、10、

40 mg/kg，每組做6個(gè)平行樣。平均回收率見表3。

5 樣品檢測(cè)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)對(duì)象蜜餞中未檢出這5種合成著色劑，為合格樣品。

6 結(jié)論

本方法以國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.35-2016為參考，建立了糕點(diǎn)中5種常用合成著色劑的液相色譜法檢測(cè)流程，并對(duì)凈化方法、儀器條件進(jìn)行了探索性驗(yàn)證，最終確立了以乙醇∶乙腈=2∶1作為樣品提取液，過柱凈化，梯度洗脫的檢測(cè)體系。目標(biāo)物檢出限符合當(dāng)前市場(chǎng)質(zhì)檢需求，回收率在90%～110%，符合要求。針對(duì)含油量較高的樣品，建議在離心后將樣液放置在4 ℃冰箱中冷藏1 h，使脂肪在上層凝結(jié)析出，取中層樣液過柱，提高凈化效率。

參考文獻(xiàn)

[1]厲芬，王鳳麗，陳敏.食品常用合成色素搞笑液相色譜檢測(cè)方法的改進(jìn)[J].食品安全導(dǎo)刊，2018（33）：92.

[2]李明輝.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定糕點(diǎn)中6種合成著色劑[J].現(xiàn)代商貿(mào)工業(yè)，2018（33）：93.

[3]陳少遷，吳紹雄，柳陳堅(jiān).三氯乙酸沉淀液態(tài)奶蛋白質(zhì)的最佳實(shí)驗(yàn)條件研究[J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，

2009（6）：278.

作者簡(jiǎn)介：唐曉偉（1989—），男，漢族，山東德州人，本科，助理工程師。研究方向：食品農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)。

晏銳銳（1984—），女，漢族，山東德州人，本科，助理工程師。研究方

向：食品農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)。

胥晶（1990—），女，漢族，山東

德州人，本科，助理工程師。研究方向：食品農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)。