樊志剛 王東 高麗 師瑞紅河南醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校

帕金森病是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其病理特征為中腦黑質(zhì)多巴胺（DA）能神經(jīng)元的大量缺失和死亡[1]，藥物治療雖有療效，但對(duì)震顫麻痹效果不好。細(xì)胞治療成為了一個(gè)新的方向，主要是將各種分化好的多巴胺能神經(jīng)原注射入紋狀體，臍血又稱胎盤血或臍帶血，含有豐富的造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞[2]，但干細(xì)胞分化為多巴胺能神經(jīng)元發(fā)比例一直不高，體內(nèi)存活時(shí)間較短，與其所處局部周圍的細(xì)胞環(huán)境有一定的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)植入的細(xì)胞與宿主損傷處的細(xì)胞相互作用可導(dǎo)致細(xì)胞因子的表達(dá)變化，這些細(xì)胞因子或炎癥介質(zhì)在功能恢復(fù)方面起著重要作用。

本次實(shí)驗(yàn)將在體外培養(yǎng)的臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(Humanumbilical cord blood -derived mesenchymal stem cell HUMSCs)定向注射到帕金森大鼠腦內(nèi)，觀察移植后對(duì)帕金森大鼠旋轉(zhuǎn)行為、TNF-α、IL-4的影響，為進(jìn)一步明確干細(xì)胞的治療機(jī)制和提高移植效果提供更多選擇。

一、材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。隨機(jī)對(duì)照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，雄性SD大鼠，220—250 g用于PD造模，實(shí)驗(yàn)中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。

2.主要試劑和儀器。6-羥基多巴胺、阿樸嗎啡，臍血干細(xì)胞提純分離試劑，ELISA試劑盒，倒置顯微鏡Olympus BX41。

3.PD模型的建立。用38g/L水合氯醛(380mg/kg)腹腔注射麻醉SD大鼠后，然后固定于立體定位儀上，參照《大鼠腦立體定位圖譜》，確定大鼠右側(cè)MFB和VTA兩點(diǎn)坐標(biāo)。向每點(diǎn)用微量進(jìn)樣器注射新鮮配置的6-OHDA溶液5μL。7天后腹腔注射阿樸嗎啡(1.2mg/kg)以誘發(fā)旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)將30只造模成功大鼠分成實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，每組15只。

4.干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)：(1)選擇健康產(chǎn)婦的產(chǎn)后臍帶血液（800～160ml）。(2) 臍帶血在30min內(nèi)利用臍血干細(xì)胞提純分離試劑進(jìn)行分離，將分離的細(xì)胞以2×107/mL接種于20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)。取第3代的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

5.臍血干細(xì)胞移植。第3代干細(xì)胞調(diào)整濃度為3.0×105μL-1，進(jìn)行細(xì)胞移植。以前囟為零點(diǎn)，定位右側(cè)紋狀體2個(gè)移植點(diǎn)：前囟前1.2 mm，矢狀縫右2.5mm，顱骨下5.2 mm；前囟前1.5 mm，矢狀縫右2.5mm，顱骨下7.3mm。實(shí)驗(yàn)組每點(diǎn)注射8μLHUMSCs，對(duì)照組按上述方法和坐標(biāo)，注入8μL的PBS。

6.觀察指標(biāo)。

（1）行為學(xué)檢測(cè)。細(xì)胞移植后3,5,7周，每組每只大鼠腹腔注射1.2mg/kg的阿撲嗎啡，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)測(cè)試，注射后20min開始計(jì)數(shù)，并計(jì)數(shù)3min。

（2） ELISA法檢測(cè)腦內(nèi)TNF-α、IL-4水平。細(xì)胞移植后3,5,7周，每組各取大鼠4只，以戊巴比妥鈉麻醉后取腦，參照周靖[3]等實(shí)驗(yàn)方法使BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行組織蛋白定量，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測(cè)TNF-α及IL-4的水平。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用所有數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，а=0.05。

二、結(jié)果

1.干細(xì)胞培養(yǎng)。倒置顯微鏡下可見，早期細(xì)胞不大且呈扁圓形，10d以后逐漸變大呈現(xiàn)桿狀(圖1)，20d(第3代)后向兩級(jí)伸出凸起為長(zhǎng)梭形(圖2)。

圖1 臍血干細(xì)胞形態(tài)（×100）

圖2 臍血干細(xì)胞形態(tài)（×100）

2.臍血干細(xì)胞移植對(duì)大鼠行為學(xué)的影響。與對(duì)照組比較，移植后3周實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)行為下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。移植后5周和7周，實(shí)驗(yàn)組旋轉(zhuǎn)次數(shù)均出現(xiàn)明顯減少，功能行為得到好轉(zhuǎn)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與移植前比較，移植后5周和7周，旋轉(zhuǎn)次數(shù)減少較多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），見下表。

移植HUMSCs前后各組帕金森病大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)(r/min)

3.臍血干細(xì)胞移植對(duì)大鼠腦內(nèi)TNF-α水平的影響。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組移植后3周，TNF-α水平下降不明顯(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)組移植后5周和7周，TNF-α水平明顯降低(P< 0.05)；與移植前比較，實(shí)驗(yàn)組移植后5周和7周，TNF-α水平均明顯下降（P< 0.05）。見下表

干細(xì)胞移植前后各組TNF-α水平的比較（ng/L）

4.臍血干細(xì)胞移植對(duì)大鼠腦內(nèi)IL-4的影響。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組移植后3周， IL-4水平升高不明顯(P>0.05); 實(shí)驗(yàn)組移植后5周和7周， IL-4水平明顯升高(P< 0.05);與移植前比較，實(shí)驗(yàn)組移植后5周和7周，IL-4水平也顯著升高（P< 0.05）。見下表

干細(xì)胞移植前后各組IL-4水平的比較（ng/L）

三、討論

目前間充質(zhì)干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞常用于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)治療PD，但胚胎干細(xì)胞取材不易，而間充質(zhì)干細(xì)胞不僅取材方便，同時(shí)增值和分化能力又比較強(qiáng)。是干細(xì)胞治療的首選細(xì)胞。臍血間充質(zhì)干細(xì)胞可誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞和間質(zhì)支持細(xì)胞，并分泌BDNF、GDNF等多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子[4]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，猴子腦內(nèi)移植臍血間充質(zhì)干細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)其逐步向黑質(zhì)內(nèi)遷移并存活，且動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)癥狀明顯改善，協(xié)調(diào)和平衡能力也逐漸好轉(zhuǎn)[5]。本研究結(jié)果也顯示，實(shí)驗(yàn)組在移植后5、7周大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)較移植前均顯著下降，表明hUMSCs移植有利于PD大鼠運(yùn)動(dòng)功能的改善。

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子構(gòu)成的炎癥免疫細(xì)胞外液環(huán)境與MSCs移植效果有一定的關(guān)聯(lián)，細(xì)胞移植后與宿主細(xì)胞發(fā)生相互影響，正性或負(fù)性調(diào)節(jié)特定細(xì)胞因子水平，進(jìn)一步影響移植細(xì)胞的存活、遷移和分化[6]。TNF-α為常見促炎性因子，它可以抑制中樞神經(jīng)的功能修復(fù)。IL-4為抗炎因子，可促進(jìn)神經(jīng)纖維再生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，移植后6周和9周，實(shí)驗(yàn)組大鼠腦內(nèi)TNF-α較對(duì)照組明顯減低,說明hUMSCs移植后可顯著抑制腫瘤壞死因子a的水平，減少炎癥反應(yīng)對(duì)對(duì)功能恢復(fù)的不利影響。相對(duì)于對(duì)照組，hUMSCs移植后6周和9周，實(shí)驗(yàn)組大鼠腦內(nèi)IL-4水平均明顯升高，說明hUMSCs移植后, IL-4的升高促進(jìn)神經(jīng)纖維再生，使大鼠旋轉(zhuǎn)行為有了明顯的改善。

有研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞是促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的分化；抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡；促進(jìn)血管再生，重建突觸等方式發(fā)揮作用的[7]。帕金森氏病主要是多巴胺能神經(jīng)元受損，會(huì)在以后的實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的含量，用免疫組化證實(shí)多巴胺能神經(jīng)元的恢復(fù)等。