鐘偉權(quán) 劉佑波 周才杰 鄭銀駒 鄔明利 梁 敏 張媛媛

1.深圳市龍崗區(qū)第五人民醫(yī)院藥劑科，深圳，518111，中國(guó)

2.北京中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院，深圳，518111，中國(guó)

3.深圳市龍崗區(qū)第五人民醫(yī)院中醫(yī)骨科，深圳，518111，中國(guó)

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種常見(jiàn)的慢性退行性骨關(guān)節(jié)的病變，該病變病程發(fā)展緩慢，伴隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)進(jìn)行性病理學(xué)加重。晚期OA 患者可能因?yàn)檐浌堑冉M織嚴(yán)重?fù)p傷而導(dǎo)致活動(dòng)和生活能力的喪失［1］。既往研究共同證實(shí)OA 是由于機(jī)械負(fù)重以及某些生物化學(xué)因素的影響，導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)、軟骨細(xì)胞和軟骨下骨的代謝失衡，其中炎癥細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激、骨關(guān)節(jié)機(jī)械力學(xué)等因素在OA 中扮演重要作用［2-3］。約80%的OA 患者存在難以自行緩解的疼痛和一定程度的運(yùn)動(dòng)受限。因此，通過(guò)有效藥物治療OA 顯得尤為迫切。

人參是五加科植物人參的干燥根，具有對(duì)多種疾病防治的效果，主要生長(zhǎng)在我國(guó)吉林省長(zhǎng)白山等地區(qū)［4］。既往研究證實(shí)，人參有效成分人參多糖能夠通過(guò)促進(jìn)葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶Ⅰ的表達(dá)，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)而改善大鼠OA［5］。人參皂苷Rb1 能夠促進(jìn)大鼠膝OA 軟骨組織中Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-13、Notch 表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)OA 作用［6］。在IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡模型中，人參皂甙Rg1 能夠降低細(xì)胞凋亡［7］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在入組30 例膝關(guān)節(jié)炎病例中，隨機(jī)分組給予對(duì)應(yīng)治療后發(fā)現(xiàn)，人參皂甙Rg1 治療組能夠有效改善患者骨關(guān)節(jié)損傷，提高其生存治療，改善膝OA 的臨床癥狀［8］。以上研究均表明人參有效活性成分能夠治療OA，但是目前有關(guān)人參有效成分對(duì)治療OA 具體分子機(jī)制以及整體藥物與疾病的關(guān)系尚不清楚。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于整體構(gòu)想，通過(guò)構(gòu)建多層次的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)即關(guān)鍵靶基因并以此對(duì)疾病的發(fā)病機(jī)制和藥物干預(yù)作用機(jī)制進(jìn)行有效預(yù)測(cè)［9］。因此，本研究擬通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從整體性角度探究人參有效成分治療OA 的分子作用機(jī)制，為研究人參治療OA 提供臨床試驗(yàn)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 人參有效活性化合物及基因靶點(diǎn)篩選

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）及中藥綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMID，http//megabionet.org/tcmid/）并按照口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類(lèi)藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 的標(biāo)準(zhǔn)篩選出人參的有效活性化合物。之后對(duì)篩選得到的化合物進(jìn)行藥物基因靶點(diǎn)的篩選。

1.2 骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因靶點(diǎn)篩選

利 用GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）和OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//omim.org/）篩選得到骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的基因靶點(diǎn)。

1.3 人參有效化合物基因靶點(diǎn)和骨關(guān)節(jié)炎基因靶點(diǎn)的交集篩選

采用R 語(yǔ)言軟件包，應(yīng)用VennDiagram 程序包，對(duì)人參活性化合物有效基因靶點(diǎn)和骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因靶點(diǎn)的篩選結(jié)果進(jìn)行取交集處理。得到能夠預(yù)測(cè)人參有效活性化合物治療骨關(guān)節(jié)炎的相關(guān)基因和蛋白作用靶點(diǎn)。

1.4 人參治療骨關(guān)節(jié)炎基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用Cytoscape（https：//cytoscape.org/）軟件，導(dǎo)入人參的有效活性成分及篩選的藥物基因靶點(diǎn)和疾病基因靶點(diǎn)的交集基因和蛋白，構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，采用力導(dǎo)向算法讓節(jié)點(diǎn)的分布更加合理，得到更佳的視覺(jué)效果。采用string 在線(xiàn)工具（https：//string-db.org/）中的Multiple proteins 功能構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein protein interaction network，PPI network），根據(jù)連接基因的數(shù)量篩選出PPI 中的核心基因。

1.5 GO 富集分析

采用R 語(yǔ)言軟件包，應(yīng)用String 和Colorspace 程序包，對(duì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的基因進(jìn)行GO 功能富集分析，并畫(huà)出富集分析的柱狀圖及氣泡圖。使用模糊聚類(lèi)算法，以注釋共同度為基礎(chǔ)對(duì)基因進(jìn)行聚類(lèi)計(jì)算，得出聚類(lèi)分值，分值同代表的基因在基因列表中重要性成正比。

1.6 KEGG 通路分析

根據(jù)GO 富集分析結(jié)果，采用R 語(yǔ)言軟件包，應(yīng)用bioconductor 程序包，進(jìn)行KEGG 通路分析，得到人參治療骨關(guān)節(jié)炎的主要信號(hào)通路。采用超幾何分布設(shè)計(jì)進(jìn)行富集分析，富集分析的顯著性按照Benjamini-Hochberg 校正法進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 人參有效活性化合物及靶點(diǎn)的篩選

按照OB≥30%和 DL≥0.18 的標(biāo)準(zhǔn)篩選出人參的有效活性化合物22 種，包括Diop，Stigmasterol，betasitosterol，Inermin，kaempferol，Chrysanthemaxanthin，Aposiopolamine，Celabenzine，Deoxyharringtonine，Dianthramine，arachidonate，F(xiàn)rutinone A，ginsenoside rh2，Ginsenoside-Rh4_qt，Girinimbin，Gomisin B，malkangunin，Panaxadiol，suchilactone，alexandrin_qt，ginsenoside Rg5_qt，F(xiàn)umarine，其分子量、OB 及DL 如Tab.1 所示。根據(jù)人參的有效活性化合物篩選的藥效靶點(diǎn)有90 個(gè)。

2.2 骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選到骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)2 856 個(gè)基因靶點(diǎn)，采用OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得到骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)155 個(gè)基因靶點(diǎn)，共計(jì)3 011 個(gè)基因靶點(diǎn)，按相關(guān)得分前20 的基因靶點(diǎn)如Tab.2 所示。

2.3 藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)的交集篩選

進(jìn)一步對(duì)90 個(gè)人參的藥效基因靶點(diǎn)、3 011 個(gè)骨關(guān)節(jié)炎的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行取交集處理，得到51 種（ADRB2，PGR，NCOA1，PTGS1，PTGS2，PLAU，SLC6A4，OPRM1，BCL2，BAX 等）可能與人參治療骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的基因作用靶點(diǎn)，如Fig.1 所示。

2.4 人參調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過(guò)采用cytoscape 成功構(gòu)建人參治療骨關(guān)節(jié)炎的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖（Fig.2），涉及到16 種化合物及51個(gè)靶點(diǎn)基因。并且采用string 工具得到人參治療骨關(guān)節(jié)炎的PPI 圖（Fig.3），節(jié)點(diǎn)表示蛋白質(zhì)，蛋白之間的關(guān)聯(lián)采用邊表示，總共涉及51 個(gè)節(jié)點(diǎn)，73 條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為2.86。節(jié)點(diǎn)大小及顏色深淺與Degree 值密切相關(guān)，隨著節(jié)點(diǎn)增大，由綠變紅所代表的Degree 值也隨之升高。邊的粗細(xì)程度則代表Combine score，隨著邊的由細(xì)變粗，Combine score 值也隨之變大。根據(jù)連接蛋白的數(shù)量篩選出PPI 中的核心蛋白包括JUN、RELA、CASP8、MAPK8、AKT1、IL1B、NCOA1、CASP3、BCL2、CASP9 等39 個(gè)（Fig.4）。

2.5 GO 富集分析

GO 富集分析為特定功能層次上由基因或蛋白數(shù)目構(gòu)成的有向無(wú)環(huán)圖，其中包括分子功能（molecular function，MF）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）及生物過(guò)程（biological process，BP）3 個(gè)方面。結(jié)果顯示基因功能主要富集在細(xì)胞核受體活性、轉(zhuǎn)化因子活性及細(xì)胞因子受體結(jié)合等，如Fig.5 所示。

Tab.1 Effective active compounds of ginseng

Tab.2 Screening of targets related to osteoarthritis

Fig.1 Intersection screening diagram of drug targets and disease targets

Fig.2 Gene regulation network diagram of ginseng in the treatment of osteoarthritis

Fig.3 The protein-protein interaction network diagram （PPI）of osteoarthritis

Fig.4 Key target proteins in the PPI network

Fig.5 Histogram of GO enrichment analysis of key target genes

2.6 KEGG 通路分析

通過(guò)采用R 語(yǔ)言對(duì)篩選得到的51 個(gè)靶基因進(jìn)行KEGG 信號(hào)通路富集分析。結(jié)果顯示共有124 條信號(hào)通路。KEGG 通路主要富集在AGE-RAGE 信號(hào)通路（MCP-1，IL-1β，IL-6，IL-8，CASP3，MMP-2 等22 個(gè)基因）、IL-17 信號(hào)通路（IL-17，IL-6，TNF-α，MMP-13，MMP-9，MMP-3，MMP-1 等17 個(gè)基因）等信號(hào)通路，結(jié)果如Fig.6 所示。

3 討論

中藥人參屬于植物人參干燥的根，是一種名貴的五加科人參藥材。中醫(yī)臨床表明人參具有補(bǔ)脾益肺、大補(bǔ)元?dú)獾裙πАＳ捎谌藚⒕哂袕?fù)雜的化學(xué)成分，具有廣泛的藥理學(xué)活性，在臨床上能夠有效的防治多種疾病。糖類(lèi)、皂苷類(lèi)以及揮發(fā)性化合物是人參的主要活性成分［10-11］。既往研究證實(shí)，人參皂苷可通過(guò)降低炎癥反應(yīng)和基質(zhì)金屬蛋白等表達(dá)，進(jìn)而改善OA 患者的臨床癥狀［12］。然而，有關(guān)于人參有效活性成分對(duì)OA 的整體網(wǎng)絡(luò)機(jī)制尚不完全清楚。本研究首先通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得到22 種有效活性化合物，主要有包括人參皂苷、人參二醇、β-谷固醇等。眾多研究均表明，人參有效活性化合物人參皂苷可以有效改善OA 患者的臨床癥狀。主要有90 個(gè)藥物基因靶點(diǎn)。GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選OA 相關(guān)基因靶點(diǎn)共3 011 個(gè)。進(jìn)一步，我們通過(guò)對(duì)藥物基因靶點(diǎn)和疾病相關(guān)基因靶點(diǎn)交集篩選共得到51 個(gè)靶基因。分別為：ADRB2，PGR，NCOA1，PTGS1，PTGS2，PLAU，SLC6A4，OPRM1，BCL2，BAX，CASP9，JUN，CASP3，CASP8，PRKCA，PON1，HTR3A，AR，PPARG，F(xiàn)7，RELA，IKBKB，AKT1，TNFSF15，MAPK8，MMP1，STAT1，HMOX1，CYP3A4，CYP1A1，ICAM1，SELE，VCAM1，CYP1B1，ALOX5，HAS2，GSTP1，AHR，NR1I3，DIO1，PPP3CA，G S T M 1，S L P I，N F K B I A，I L 1 B C A S P 1，I F N G，MAP2K4，NR3C1，OPRD1，KDR。

Fig.6 KEGG enrichment analysis histogram of key target genes

為進(jìn)一步明確人參活性成分和OA 之間的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，通過(guò)cytoscape 成功構(gòu)建人參治療骨關(guān)節(jié)炎的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，共涉及16 種有效活性化合物和51 個(gè)基因靶點(diǎn)。String 工具篩選得到核心蛋白包括JUN、RELA、CASP8、MAPK8、AKT1、IL1B、NCOA1、CASP3、BCL2、CASP9 等39 個(gè)。39 個(gè)核心靶基因大致可歸為炎癥相關(guān)蛋白、凋亡相關(guān)蛋白和其他相關(guān)蛋白。既往研究證實(shí)，人參皂苷Rg1 可以通過(guò)上調(diào)p-Akt，升高B 淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）/Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl2-Associated X Protein，Bax），抑制活性caspase-3 表達(dá)，進(jìn)而降低大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡［13］。在糖尿病腎病大鼠模型中，人參皂苷Rg1 大鼠灌胃處理可以通過(guò)降低大鼠血清中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和IL-1β等炎癥因子含量，改善糖尿病腎病大鼠進(jìn)程［14］。另外，在Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞毒性模型中，人參皂苷Rf 可以抑制caspase-1，IFN-γ活性，增加IL-13 活性，進(jìn)而改善神經(jīng)細(xì)胞損傷狀況［15］。以上研究表明，人參有效成分可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡，炎癥途徑等改善OA。

GO 功能主要富集在細(xì)胞核受體活性、轉(zhuǎn)化因子活性以及細(xì)胞因子受體結(jié)合等。KEGG 通路主要富集在AGE-RAGE、IL-17 和TNF 等信號(hào)通路。以往研究在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中，外周血清中IL-17、TNF-α、IL-6 等含量顯著升高［16］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)給予人參皂苷處理可以有效降低OA 患者外周血中炎癥細(xì)胞因子IL-17、IL-6 和TNF-α的含量，改善OA 的臨床癥狀［17］。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從生物網(wǎng)絡(luò)平衡的整體觀角度聯(lián)系藥物同機(jī)體的相互作用，通過(guò)生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的連接和關(guān)系來(lái)分析網(wǎng)絡(luò)特性，進(jìn)一步闡明藥物作用機(jī)制，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，可以預(yù)測(cè)和分析藥物作用的新靶點(diǎn)。人參治療骨關(guān)節(jié)炎的主要藥效靶點(diǎn)基因和作用機(jī)制還需進(jìn)行深入的實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證。另外本研究預(yù)測(cè)結(jié)果提示人參在動(dòng)脈粥樣硬化、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌等治療中有潛在的應(yīng)用價(jià)值，能夠?yàn)槿藚⒌奈磥?lái)研究方向提供有力的參考依據(jù)。