龍惠東，王鳳，吳迪，鄧偉芬，黃玉群，李宇彬

(1.東莞廣濟(jì)醫(yī)院生殖中心，東莞 523000；2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣州 510000；3.深圳恒生醫(yī)院，深圳 518000)

隨著輔助生殖技術(shù)的快速發(fā)展，體外受精-胚胎移植術(shù)(IVF-ET)已成為治療不孕癥的重要助孕方法。除了胚胎質(zhì)量外，子宮內(nèi)膜因素是影響IVF-ET成功的一大重要因素，臨床上常見由于反復(fù)宮腔操作導(dǎo)致子宮內(nèi)膜炎癥、粘連，或不明原因的內(nèi)膜變薄，降低了IVF-ET的周期妊娠率。如何改善薄型子宮內(nèi)膜患者的內(nèi)膜厚度及臨床結(jié)局，是生殖醫(yī)學(xué)工作者所關(guān)注的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。宮腔灌注是臨床上治療薄型子宮內(nèi)膜的常用方法，主要有粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)宮腔灌注治療，以及近年來報(bào)道的富血小板血漿(PRP)宮腔灌注治療。不同的灌注物之間是否存在治療效果差異尚未有定論。本研究擬探討PRP與G-CSF宮腔灌注對薄型子宮內(nèi)膜患者行IVF助孕臨床結(jié)局的效果，以選擇更優(yōu)的方法用于臨床治療。

材料與方法

一、研究對象

2018年7月至2020年3月在東莞廣濟(jì)醫(yī)院生殖中心行凍融胚胎移植的薄型子宮內(nèi)膜患者。

納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≤38歲；既往至少兩次自然排卵周期或促排卵周期卵泡成熟時(shí)內(nèi)膜厚度≤7 mm，或激素替代人工周期(HRT)準(zhǔn)備子宮內(nèi)膜時(shí)，雌激素持續(xù)用藥12 d時(shí)內(nèi)膜厚度≤7 mm；本次移植至少有1個(gè)為優(yōu)質(zhì)胚胎。

排除標(biāo)準(zhǔn)：既往有腫瘤病史；合并巨大子宮肌瘤(直徑>4 cm)；嚴(yán)重子宮腺肌病患者；對G-CSF過敏者。

共納入229例患者?；颊咧橥夂蟛扇‰S機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為3組：80例接受PRP宮腔灌注治療(PRP組)，81例接受G-CSF宮腔灌注治療(G-CSF組)，68例接受生理鹽水宮腔灌注(對照組)。

本研究經(jīng)東莞廣濟(jì)醫(yī)院生殖中心醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、治療方案

1.子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案及內(nèi)膜測量：對月經(jīng)周期規(guī)則、有正常排卵的患者選擇自然或促排卵周期方案或HRT方案；對無正常排卵患者選擇HRT方案。

HRT方案：于月經(jīng)第2～3天開始口服戊酸雌二醇(補(bǔ)佳樂，拜耳，德國) 4～8 mg/d，并根據(jù)內(nèi)膜及血激素水平調(diào)整劑量，雌激素持續(xù)用藥12～16 d及雌二醇水平>734 pmol/L時(shí)予以內(nèi)膜轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化日開始給予黃體支持用藥。

胚胎移植當(dāng)日檢測子宮內(nèi)膜厚度及內(nèi)膜血流，內(nèi)膜測量值均在兩名超聲醫(yī)生的核對后得出結(jié)果。檢測到內(nèi)膜和內(nèi)膜下均無血流為A級(jí)內(nèi)膜，僅檢測到內(nèi)膜下有血流為B級(jí)內(nèi)膜，內(nèi)膜和內(nèi)膜下均檢測到血流為C級(jí)內(nèi)膜[1]。

2.PRP的制備：全程嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，制作方法參考文獻(xiàn)報(bào)道[2]：抗凝管抽取患者肘靜脈血15 ml，留取1 ml全血進(jìn)行血小板(PLT)計(jì)數(shù)，剩余14 ml全血進(jìn)行PRP制備：將血標(biāo)本放進(jìn)2個(gè)離心管中，215g離心10 min；離心后的標(biāo)本吸取全部上清、白膜層及以下2 mm的紅細(xì)胞層轉(zhuǎn)移到新的離心管中進(jìn)行第2次離心，863g離心10 min；后棄掉3/4上清液剩余約1.0 ml吹打均勻即PRP。留取0.2 ml計(jì)數(shù)PLT，全自動(dòng)血液分析儀(Siemens Advia 2120i，德國) 計(jì)數(shù)全血及 PRP中的PLT數(shù)量。

3.宮腔內(nèi)灌注：自然周期或促排周期中優(yōu)勢卵泡約12 mm時(shí)或HRT周期用藥第8天子宮內(nèi)膜厚度≤6 mm時(shí)，在PRP組給予PRP宮腔內(nèi)灌注1次，G-CSF組給予G-CSF(惠爾血，協(xié)和發(fā)酵麒麟，日本)300 μg(0.7 ml)宮腔內(nèi)灌注1次，對照組予生理鹽水0.7 ml宮腔灌注；在轉(zhuǎn)化日再次給予宮腔灌注以強(qiáng)化治療效果。

宮腔灌注操作：常規(guī)消毒鋪巾下，患者采取膀胱截石位，用人工授精管(COOK，美國)抽吸0.8 ml患者自體PRP(PRP組)或G-CSF 300 μg(G-CSF組)或0.7 ml生理鹽水(對照組)，在腹部超聲引導(dǎo)下經(jīng)宮頸插入宮腔，看到管尖在宮腔中部時(shí)，將灌注液在無阻力下緩慢注入宮腔，將液體全部推入宮腔后緩慢外退管芯后完成，術(shù)后患者平臥休息30 min。

4.胚胎解凍移植及黃體支持：胚胎解凍后對胚胎進(jìn)行評分，移植2枚卵裂期胚胎或1枚囊胚，卵裂胚至少有1枚為優(yōu)質(zhì)胚胎(7～9細(xì)胞，碎片率<30%的I級(jí)或II級(jí)胚胎)。3組黃體支持方案統(tǒng)一為：地屈孕酮片(達(dá)芙通，蘇威制藥，荷蘭)20 mg 2次/日口服+黃體酮軟膠囊(安琪坦，Besins，比利時(shí)) 200 mg 2次/日陰道給藥。移植后14 d驗(yàn)血HCG值，移植后30 d超聲下見妊娠囊定義為臨床妊娠。

三、觀察指標(biāo)

患者一般資料；治療前(前次移植日)、治療后移植日內(nèi)膜厚度及血流分級(jí)；平均移植胚胎數(shù)、胚胎種植率、臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率。胚胎種植率=(超聲下孕囊個(gè)數(shù)/移植胚胎數(shù))×100%，臨床妊娠率=(超聲下見孕囊例數(shù)/移植總例數(shù))×100%，早期流產(chǎn)率=(孕12周前流產(chǎn)例數(shù)/臨床妊娠例數(shù))×100%。

四、統(tǒng)計(jì)方法

結(jié) 果

一、各組患者的一般情況比較

3組患者間年齡、不孕年限、既往人流次數(shù)、體重指數(shù)(BMI)、抗苗勒管激素(AMH)、基礎(chǔ)卵泡刺激素(FSH)、基礎(chǔ)黃體生成素(LH)、基礎(chǔ)雌二醇(E2)、基礎(chǔ)孕酮(P)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0. 05)(表1)。

表1 三組患者一般情況比較 (-±s)

二、PRP組中PRP的制備情況

PRP的制備均在千級(jí)層流實(shí)驗(yàn)室無菌操作下進(jìn)行，宮腔灌注術(shù)后均未出現(xiàn)感染等不良反應(yīng)。PRP中PLT濃度為全血的3.16倍[(433.83±36.76)×109/L vs. (137.17±24.94)×109/L，P<0.001)]。

三、各組子宮內(nèi)膜厚度及血流分級(jí)比較

3組間既往周期移植日(表2中定義為“治療前”)的內(nèi)膜厚度無顯著性差異(P>0.05)；PRP組及G-CSF組治療后移植日內(nèi)膜厚度均較既往周期移植日內(nèi)膜厚度顯著增厚(P<0.001)，且顯著優(yōu)于對照組(P<0.001)(表2)。

灌注治療后3組的內(nèi)膜血流分級(jí)比較均有顯著性差異(P<0.05)，PRP組及G-CSF組的B及C級(jí)血流患者比例顯著高于對照組(P<0.05)(表2)。

四、各組胚胎移植及妊娠結(jié)局比較

3組間移植胚胎數(shù)、胚胎種植率、臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

表2 三組患者宮腔灌注治療前后移植日內(nèi)膜厚度及血流分級(jí)[(-±s)，n(%)]

表3 三組間妊娠結(jié)局的比較[(-±s)，%]

討 論

在輔助生殖技術(shù)中，子宮內(nèi)膜厚度及內(nèi)膜血流是評估子宮內(nèi)膜容受性的常用指標(biāo)，成功妊娠的理想內(nèi)膜厚度是9～12 mm，內(nèi)膜下血流豐富者有著更高的臨床妊娠率[3]。有臨床研究發(fā)現(xiàn)移植日的子宮內(nèi)膜厚度低于7 mm者臨床妊娠率僅有23.1%[4]，內(nèi)膜菲薄一直是生殖醫(yī)生所面對的棘手問題。近年來對薄型子宮內(nèi)膜的處理有很多不同方法，如宮腔灌注治療、血管活性藥物(西地那非、阿司匹林等)、生物電刺激、雌激素補(bǔ)充、中藥針灸及干細(xì)胞治療等，宮腔灌注的藥物可直接與內(nèi)膜局部作用，是較多臨床醫(yī)生常選擇的治療手段，但不同的灌注藥物該如何選擇，不同的藥物之間是否有明顯差異值得探討。本研究提示PRP或G-CSF宮腔灌注均可以改善子宮內(nèi)膜厚度及內(nèi)膜血流分級(jí)。

PRP宮腔灌注是治療薄型子宮內(nèi)膜近年來摸索的新方法。PRP中血小板的數(shù)目比全血中數(shù)目高3倍以上，且富含有多種生長因子，可誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、分化和增殖，自體PRP應(yīng)用于口腔及骨關(guān)節(jié)外科，得到了良好的臨床療效[5]。PRP中高濃度的血小板被激活后能釋放血小板源性生長因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、表皮生長因子(EGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF) 等，通過脫顆粒方式結(jié)合到細(xì)胞膜表面，促進(jìn)子宮內(nèi)膜組織生長[6-7]，Bertrand-Duchesne等[8]報(bào)道PRP多種生長因子中，以EGF的作用較為重要，可促進(jìn)體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞增長。近年來開始將PRP應(yīng)用于薄型子宮內(nèi)膜的患者，探討應(yīng)用PRP灌注改善IVF-ET治療中薄型子宮內(nèi)膜患者的臨床結(jié)局[9-10]；國內(nèi)也有報(bào)道PRP治療提高患者的內(nèi)膜厚度及IVF的臨床妊娠率[11-12]。本研究結(jié)果提示PRP宮腔灌注后患者的子宮內(nèi)膜厚度及內(nèi)膜血流得到改善，但臨床妊娠率與對照組沒有顯著性差異，可能是樣本量不足的原因。

G-CSF是刺激骨髓造血細(xì)胞增殖分化的細(xì)胞因子，文獻(xiàn)報(bào)道在女性生殖方面它也參與了子宮內(nèi)膜的生長、發(fā)育，在人子宮內(nèi)膜和母胎界面均有G-CSF及其受體的表達(dá)[13]，為近幾年G-CSF在生殖醫(yī)學(xué)的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。Gleicher等[14]首次報(bào)道應(yīng)用G-CSF治療薄型子宮內(nèi)膜獲得較好的妊娠結(jié)局，提示G-CSF可能具有促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞增生及刺激內(nèi)膜血管網(wǎng)再生等作用。也有多項(xiàng)Meta分析指出宮腔內(nèi)灌注G-CSF可促進(jìn)IVF-ET周期子宮內(nèi)膜生長并提高臨床妊娠率[15-18]。G-CSF除了增加子宮內(nèi)膜的厚度，還可改善子宮內(nèi)膜的容受性，可能與其在子宮內(nèi)膜的受體表達(dá)有關(guān)系[19-20]。本研究提示G-CSF宮腔灌注可以改善薄型子宮內(nèi)膜患者的子宮內(nèi)膜厚度及內(nèi)膜血流，但臨床妊娠率與對照組也沒有顯著性差異，可能是樣本量不足的原因，有待進(jìn)一步加大樣本量深入研究。

兩種灌注方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。PRP制作來源于自體的血清，不會(huì)發(fā)生血源性感染和誘發(fā)胚胎變態(tài)反應(yīng)等問題，安全性已得到文獻(xiàn)證實(shí)[5]。PRP灌注從外科應(yīng)用引入到生殖科，其原理更側(cè)重于促進(jìn)增殖、修復(fù)、愈合的作用，其中的多種因子在體內(nèi)緩慢釋放，并且還富含纖維蛋白、纖維結(jié)合蛋白等纖維網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)細(xì)胞黏附，推測PRP灌注可能更適合于宮腔粘連等內(nèi)膜損傷的薄型子宮內(nèi)膜患者；采血收集PRP對患者有一定的創(chuàng)傷性，其制作比較繁瑣而且對實(shí)驗(yàn)室無菌操作有一定要求，不同實(shí)驗(yàn)室操作標(biāo)準(zhǔn)的差異也可能影響其有效性。G-CSF灌注選用的是現(xiàn)有的成品藥物，不需要特殊制備，應(yīng)用相對簡便，藥品出廠經(jīng)過嚴(yán)格質(zhì)控更加安全，而且對患者是無創(chuàng)的，但可能存在極個(gè)別患者對藥物過敏不能使用，而且理論上單一的生長因子對促進(jìn)細(xì)胞增殖與修復(fù)的作用沒有多因子的復(fù)合作用強(qiáng)，G-CSF可能對非病理性損傷的薄型子宮內(nèi)膜更合適，將來可以進(jìn)一步分類研究探討。

本研究比較了PRP及G-CSF兩種宮腔灌注方法在薄型子宮內(nèi)膜患者中的治療作用，為臨床治療提供了新的方法和思路。研究結(jié)果顯示兩種方法在提高薄型子宮內(nèi)膜患者的內(nèi)膜厚度及血流、改善臨床妊娠率方面均無顯著性差異，提示兩種方法效果相似。G-CSF宮腔灌注由于其使用上的便捷性、安全性及無創(chuàng)性，可接受性更強(qiáng)，臨床上可以推薦應(yīng)用于薄型子宮內(nèi)膜患者；而PRP宮腔灌注臨床使用安全有效，在缺乏G-CSF藥物時(shí)或?qū)-CSF過敏患者也不失為一種有效的治療手段，臨床上也可以根據(jù)患者情況和實(shí)驗(yàn)室條件進(jìn)行選擇。