徐先棟，王海華，李燕華，吳 斌，馬本賀，曾慶祥

（1. 江西省水產(chǎn)科學(xué)研究所，江西 南昌 330039；2. 贛州市水產(chǎn)研究所，江西 贛州 341199）

大刺鰍（Mastacembelus armatus），屬于鱸形目 （Perciformes）[1]，也有學(xué)者通過分子標(biāo)記分類鑒定結(jié)果， 認(rèn)為大刺鰍屬于合鰓目[2-3]，刺鰍科（Mastacembelidae）、刺鰍屬（Mastacembelus），俗稱辣錐、石錐、刀鰍、粗麻割、鐮刀魚等，主要分布于我國東南地區(qū)，是一種小型淡水魚類，棲息于有石塊的江河底層，或岸邊有水草的深潭石縫處[4]。其肉質(zhì)鮮美，富含氨基酸和礦物元素[5]。該魚因其外觀特殊，體表有棘刺，原來不受市場重視，關(guān)注較少，近年來，隨著人們對該物種認(rèn)識的不斷提高，加上其本身肉嫩味佳，無肌間刺，而且營養(yǎng)價值高，深受消費者喜愛，其良好的市場開發(fā)價值日益得到體現(xiàn)。目前對大刺鰍的遺傳生物學(xué)如核型、線粒體遺傳多態(tài)性等有少量的報道，如李芬等[6]對屬珠江水系干流的北江大刺鰍核型及線粒體基因的遺傳多樣性進行了研究，對大刺鰍的同工酶研究目前鮮見報道，為此筆者采集江西省信豐縣桃江水域大刺鰍進行了同工酶研究，旨在豐富大刺鰍的遺傳生物學(xué)數(shù)據(jù)，為大刺鰍的種質(zhì)資源保護以及開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用大刺鰍采自江西省信豐縣桃江水域。魚體體長約25 cm，體重55 g 左右，充氧運輸至實驗室，并在玻璃缸中充氣暫養(yǎng)，缸底放置直徑為5 cm，長度為30 cm 的聚乙烯管，為大刺鰍提供棲息和隱蔽場所，每天投喂鮮活小雜魚一次，暫養(yǎng)一周后，魚狀態(tài)正常，采樣試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 酶液提取 取大刺鰍肝臟、脾臟、肌肉、腎臟、心臟和腦6 種組織少許，雙蒸水沖洗干凈，濾紙吸干表面水分，置于離心管中，按1 ∶3（W/V）加入0.1 mol/L 的磷酸緩沖液（pH 值7.0），首先使用消毒后的手術(shù)剪把組織剪成小塊，然后再使用電動研磨器冰浴研磨成勻漿狀。完成后于4℃下10 000 r/min 離心30 min，吸取上清液，-20℃儲存，盡快用于電泳分析。

1.2.2 電 泳采用垂直平板不連續(xù)聚丙烯酞胺凝膠電泳法，電泳系統(tǒng)為NuPAGE Bis-Tris蛋白預(yù)制膠套裝，包括invitrogen Mini Gel Tank 小型電泳槽，NuPAGE 蛋白預(yù)制梯度凝膠（濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為12%）NuPAGE LDS Sample buffer 緩沖液。20 μL 樣品與2 μL 指示劑溴酚蘭混合一起上樣，首先使用80 V電泳至樣品壓縮成一細(xì)線并跑出濃縮膠后，調(diào)大電壓至120 V 繼續(xù)進行分離膠電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)的邊緣到達凝膠底部時，停止電泳，整個電泳過程約30 min。

凝膠電泳完畢后立即取下，用雙蒸水漂洗干凈，置于染色液中于37℃染色，染色方法參照國標(biāo)進 行[7]，染色完成后，用雙蒸水漂洗干凈，保存于7%醋酸中。用數(shù)碼相機及伯樂（Bio-Rad）凝膠成像系統(tǒng) （Gel Doc XR+）拍攝同工酶圖譜。

同工酶的命名方法參照徐先棟等方法進行[8]。以向陽極方向泳動最快的編為1 號，依次各酶帶分別編為2、3、4……n 號。重復(fù)試驗2 次。同工酶在各組織中的含量以示意圖中條帶粗細(xì)及顏色深淺來表示，條帶粗、顏色深表示酶的含量高。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸脫氫酶酶譜表型

大刺鰍乳酸脫氫酶同工酶共檢測到5 條酶帶，在肌肉中均能檢測到5 條，在肝臟中檢測到4 條，在脾臟、腎臟及心臟檢測到1 條，腦組織中未檢測到乳酸脫氫酶表達（圖1）。在肝臟中乳酸脫氫酶表達活性最高。

2.2 酯酶酶譜表型

大刺鰍酯酶同工酶共檢測到6 條酶帶，在肌肉中檢測到4 條，肝臟、脾臟、腎臟和心臟中均檢測到2 條，腦組織中檢測到1 條（圖2）。在肝臟中酯酶表達活性最高，其次為腎臟、脾臟。

圖1 大刺鰍不同組織乳酸脫氫酶電泳圖譜及酶譜示意圖

圖2 大刺鰍不同組織酯酶電泳圖譜及酶譜示意圖

3 討 論

乳酸脫氫酶（LDH）是研究最早也是比較深入的一種同工酶，它是糖酵解過程中的關(guān)鍵酶之一，在氧氣充足的組織中，如心臟中催化乳酸脫氫氧化為丙酮酸，參與三羧酸循環(huán)[9]，在厭氧器官組織中，如肝臟、肌肉組織中催化丙酮酸還原為乳酸。研究表明，魚類LDH 同工酶是由多基因決定的，分布存在明顯的組織特異性[10]。LDH 同工酶一般由M 和H 蛋白亞基組成，LDH-M、LDH-H基因表達形成四聚體，從陰極到陽極依次排列為M4（LDH5）、M3H（LDH4）、M2H2（LDH3）、MH3（LDH2）、H4（LDH1）5 種組合方式，表現(xiàn)為5 條酶帶[9]。研究在大刺鰍肌肉中檢測到LDH5 種同工酶，在其他組織中分別檢測到0～3條不等，表明大刺鰍的LDH 同工酶存在明顯的組織差異性。在肌肉和肝臟嫌氣性組織中酶活最強，表明同工酶催化丙酮酸還原為乳酸的反應(yīng)占優(yōu)勢，與大刺鰍習(xí)性溫和，棲息于礫石底的江河溪流中，常藏匿于石縫或洞穴中低氧環(huán)境相適應(yīng)。

另外，在多數(shù)二倍體魚類中，LDH 同工酶表現(xiàn)為M、H 基因編碼的M、H 亞基構(gòu)成的5 條譜帶[11]，由此可以推測大刺鰍應(yīng)為二倍體魚類。此外，大刺鰍不同組織乳酸脫氫酶中，肌肉組織中5 條帶表達穩(wěn)定，腦組織中無LDH 條帶，這2 種組織可作為大刺鰍種質(zhì)鑒定的標(biāo)志酶取樣部位。

酯酶屬于水解酶類，能催化酯健水解，目前酯酶的遺傳基礎(chǔ)和亞基組成尚無定論，一般認(rèn)為在硬骨魚類中EST 是單體或二聚體，由多個基因位點編碼，多態(tài)現(xiàn)象普遍[12]。研究結(jié)果同此結(jié)論相似，大刺鰍各組織中酯酶的分布具有多態(tài)性。研究大刺鰍酯酶在肝臟中表達活性最強，腎臟次之，同李雅娟等[13]研究黃顙魚體內(nèi)酯酶結(jié)果相類似。肝臟是重要的解毒器官，主要起解毒作用的就是酯酶，酯酶除了維持細(xì)胞正常的能量代謝外，還能水解大量非生理性存在的酯類化合物，認(rèn)為可能與機體的解毒作用密切相關(guān)，大刺鰍肝臟中的酯酶含量豐富，與肝臟的解毒功能是相適應(yīng)的。腎臟是重要的排泄器官，肝臟分解的有毒物質(zhì)通過腎臟排出體外，因而與之相適應(yīng)其酯酶同工酶亦表現(xiàn)出活力強的酶帶。肌肉組織功能相對單一，酶譜帶表達穩(wěn)定，如研究大刺鰍肌肉組織中4 條酶帶，表達穩(wěn)定清晰，且不同于其他組織，具有特異性，與LDH同工酶一樣，可以作為大刺鰍種植鑒定的標(biāo)志酶取樣部位。