劉加林 賈永義 劉士力 鄭建波 遲美麗程 順 李 飛 尹紹武 顧志敏①

太湖魴鲌F(tuán)2代GH基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育和表達(dá)特征*

劉加林1, 2賈永義1劉士力1鄭建波1遲美麗1程 順1李 飛1尹紹武2顧志敏1①

(1. 浙江省淡水水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/浙江省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖州 313001; 2. 南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 南京 210023)

采用PCR及T-A克隆技術(shù), 從基因組DNA成功克隆三角魴、太湖魴鲌、太湖魴鲌F(tuán)2代含完整閱讀框的生長(zhǎng)激素基因全序列, 經(jīng)測(cè)序拼接獲得序列全長(zhǎng)分別為6009、6042和6058bp, 轉(zhuǎn)錄單元長(zhǎng)分別為2049、2014和2045bp。三種群體的GH基因序列均包括五個(gè)外顯子、四個(gè)內(nèi)含子及5′側(cè)翼區(qū)和3′側(cè)翼區(qū); 編碼氨基酸序列均為633bp, 編碼210個(gè)氨基酸。對(duì)3個(gè)目14種魚類進(jìn)行同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn), 太湖魴鲌F(tuán)2代與其祖父母的遺傳距離相比親本較近。另取10尾太湖魴鲌F(tuán)2代, 對(duì)其進(jìn)行GH基因編碼區(qū)SNPs篩選, 共得到7處SNPs, 其中有3處位點(diǎn)的突變導(dǎo)致其氨基酸序列發(fā)生了明顯的變化; 對(duì)其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn), 突變后的氨基酸殘基導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。我們將該10尾個(gè)體按體重分為小個(gè)體組和大個(gè)體組, 經(jīng)組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn), 大個(gè)體組中的個(gè)體具有較高的轉(zhuǎn)錄水平, 進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)其氨基酸殘基有所不同。

太湖魴鲌; 屬間雜交; 生長(zhǎng)激素; 克隆; SNPs; 表達(dá)分析

太湖魴鲌(♀×♂)是以經(jīng)兩代群體選育和兩代異源雌核發(fā)育誘導(dǎo)的翹嘴鲌()為母本, 連續(xù)三代群體選育的三角魴()為父本, 通過遠(yuǎn)緣雜交獲得的國(guó)家水產(chǎn)新品種(GS-02-001- 2017), 具有生長(zhǎng)快、飼料轉(zhuǎn)化率高、體型適中、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn), 適宜在全國(guó)可控水域推廣養(yǎng)殖。與大多雜種優(yōu)勢(shì)利用類似, 太湖魴鲌也是父母本雜交一代的經(jīng)濟(jì)性狀優(yōu)勢(shì)利用, 其自交后代具有顯著的性狀分離現(xiàn)象(姜建湖等, 2019), 不適宜推廣養(yǎng)殖, 但在自交后代中不乏生長(zhǎng)、體型、鱗片等顯著優(yōu)勢(shì)的個(gè)體, 可作為后代品種選育的優(yōu)良育種素材。

生長(zhǎng)激素(growth hormone, GH)是能夠調(diào)節(jié)控制動(dòng)物內(nèi)分泌機(jī)制, 使進(jìn)入機(jī)體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)按動(dòng)物生長(zhǎng)的需求朝著有益的方向進(jìn)行再分配功能的各類激素的總稱, 可以調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)、肢體的發(fā)育以及細(xì)胞的定向分化等(嚴(yán)美姣等, 2010)。魚類的生長(zhǎng)激素與催乳素(prolactin, PRL)和胎盤催乳素(placental lactogen, PL)屬于同一個(gè)基因家族(楊學(xué)明等, 2008), 是影響動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的主效基因(M?ller,2007)。楊學(xué)成等(1991)最早從大麻哈魚()腦垂體cDNA文庫(kù)中克隆得到全長(zhǎng)為1.12kb的GH cDNA。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展, 除了在禽畜物種上對(duì)GH基因的大量研究外(宋成義等, 2000; 王文君等, 2003), 對(duì)魚類GH基因也有大量報(bào)道。已有研究表明, 鯉魚()(Hong, 1993)、草魚()(Ho, 1991)、鯰魚()(Tang, 1993)等大多數(shù)魚類存在5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子, 斜帶石斑魚()和翹嘴鱖()等少數(shù)魚類具有6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子(Almuly, 2000; 魯雙慶等, 2008; Ma, 2012)。本團(tuán)隊(duì)已對(duì)翹嘴鲌GH基因(劉士力等, 2019)及兩種生長(zhǎng)激素受體(GHR)進(jìn)行了分析(劉士力等, 2020), 均發(fā)現(xiàn)了微衛(wèi)星位點(diǎn)且部分位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀具有關(guān)聯(lián)性。在GH基因的5′端側(cè)翼區(qū)發(fā)現(xiàn)2個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn), 且與體長(zhǎng)、體質(zhì)量等生長(zhǎng)性狀具有關(guān)聯(lián)性; GHR1和GHR2中均發(fā)現(xiàn)了微衛(wèi)星序列, 其中GHR2基因所發(fā)現(xiàn)的4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)均具有多態(tài)性, 且均與生長(zhǎng)性狀相關(guān)。本研究通過克隆獲得三角魴、太湖魴鲌、太湖魴鲌F(tuán)2代的GH基因全長(zhǎng)序列, 分析其序列所具有的差異性; 并單獨(dú)對(duì)太湖魴鲌F(tuán)2代GH基因進(jìn)行SNPs的篩選以及組織表達(dá)分析, 探究基因結(jié)構(gòu)的改變對(duì)基因表達(dá)帶來的影響。本研究結(jié)果將有助于闡明決定快速生長(zhǎng)相關(guān)性狀的分子機(jī)制, 也將有助于對(duì)未來太湖魴鲌新品種標(biāo)記輔助選擇育種提供良好的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

實(shí)驗(yàn)所用翹嘴鲌、三角魴、太湖魴鲌及太湖魴鲌F(tuán)2代均來自于浙江省淡水水產(chǎn)研究所綜合試驗(yàn)基地, 均剪取少量尾鰭于無水乙醇中–20°C保存, 用于后續(xù)DNA的提取; 從F2代群體中篩選出體重(BW)、體長(zhǎng)(BL)和體高(BH)等性狀差異較大的10尾魚, 對(duì)每尾魚進(jìn)行形態(tài)測(cè)量后分別剪取尾鰭用于DNA的提取, 并取適量的肌肉組織分成3份經(jīng)樣品保護(hù)液(Sample Protector for DNA/RNA) 4°C過夜后于–80°C保存, 用于RNA的提取。

1.2 GH基因的克隆及SNPs篩選

本課題組已獲得翹嘴鲌GH基因序列全長(zhǎng)(劉士力等, 2017), NCBI登錄號(hào)為KX925976。利用已獲得的三角魴、太湖魴鲌、太湖魴鲌F(tuán)2代轉(zhuǎn)錄組中GH的mRNA序列進(jìn)行Blast, 發(fā)現(xiàn)均與翹嘴鲌和團(tuán)頭魴()(登錄號(hào): AF463498)推測(cè)的mRNA序列相似度極高, 根據(jù)其保守區(qū)域和已知序列設(shè)計(jì)7對(duì)特異性引物(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序均按照劉加林等(2019)方法進(jìn)行實(shí)施, PCR產(chǎn)物克隆后送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

從F2代群體中挑選出10尾體型具有明顯差異的個(gè)體, 通過克隆及測(cè)序獲得每尾魚的GH基因全序列, 對(duì)該10條序列進(jìn)行對(duì)比, 篩選出編碼區(qū)SNPs。

表1 GH基因克隆PCR引物序列

Tab.1 Primer sequences used for GH gene cloning

1.3 GH基因的生物學(xué)分析

所獲得的DNA片段和已知的mRNA序列拼接及對(duì)比按照劉加林等(2019)等的方法進(jìn)行, 以確定三角魴、太湖魴鲌、太湖魴鲌F(tuán)2代GH基因正確性。GH基因的mRNA及編碼的氨基酸序列按照劉士力等(2016)等的方法進(jìn)行分析。微衛(wèi)星和小衛(wèi)星的查找分別通過SSRhunter 1.3和在線軟件Repfind進(jìn)行。利用MEGA 7.0軟件采用鄰接法(neighbor-jioning method)將翹嘴鲌、三角魴、太湖魴鲌、太湖魴鲌F(tuán)2代同鱸形目(Perciformes)、鯉形目(Cypriniformes)、鲇形目(Siluriformes)在內(nèi)的共14種魚類進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

利用在線軟件分別對(duì)10尾F2代個(gè)體GH基因蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè); ExPASy和NCBI 中Conserved Domains (CD-Search)程序?qū)τ袩o跨膜結(jié)構(gòu)及保守的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè); SignalP和PredictProtein對(duì)信號(hào)肽及蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.4 GH基因的定量表達(dá)分析

將RNA進(jìn)行提取與檢測(cè)以及反轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 具體方法按照說明書進(jìn)行。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)得到的F2代GH基因的開放閱讀框cDNA序列, 設(shè)計(jì)合成一對(duì)跨內(nèi)含子的正反向特異熒光定量引物GH, 并且以內(nèi)參基因EFα1作為對(duì)照(表1)。實(shí)時(shí)定量操作具體步驟按照劉士力等(2019)的方法進(jìn)行, 目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)表達(dá)量用qRT(Roche)軟件按照Livak等(2001)描述的方法計(jì)算, 使用Excel繪制直方圖。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性, 每個(gè)樣品, 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的反應(yīng)都進(jìn)行了三次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 太湖魴鲌與親本及太湖魴鲌F(tuán)2代GH基因序列全長(zhǎng)分析

采用長(zhǎng)片段PCR及T-A克隆技術(shù), 從基因組DNA成功克隆三角魴、太湖魴鲌(翹嘴鲌♀×三角魴♂)和太湖魴鲌F(tuán)2代含完整閱讀框的生長(zhǎng)激素基因全序列。本課題組已成功克隆出翹嘴鲌GH基因全長(zhǎng)序列, 為5966bp, 轉(zhuǎn)錄單元長(zhǎng)1648bp。經(jīng)測(cè)序拼接獲得三角魴、太湖魴鲌和太湖魴鲌F(tuán)2代序列全長(zhǎng)分別為6009、6042和6058bp; 轉(zhuǎn)錄單元長(zhǎng)分別為2049、2014和2045bp。四種群體GH基因序列均包括五個(gè)外顯子、四個(gè)內(nèi)含子及5′側(cè)翼區(qū)和3′側(cè)翼區(qū); 編碼氨基酸序列均為633bp, 編碼210個(gè)氨基酸。其序列組成及長(zhǎng)度見表2。

太湖魴鲌和親本及太湖魴鲌F(tuán)2代GH全基因序列的各自A、T、C、G的堿基含量近乎一致, 其中翹嘴鲌和三角魴的AT總含量均為65.0%, 太湖魴鲌和太湖魴鲌F(tuán)2代的AT總含量均為64.8%, 該四種群體均顯示出了一致的AT偏好性。由此可知, 太湖魴鲌F(tuán)2代的GH基因序列全長(zhǎng)雖然稍大于其親本及祖父母本, 但其AT、CG的總含量與該三種群體無明顯差異, 說明太湖魴鲌F(tuán)2代在堿基組成方面具有穩(wěn)定遺傳性。

表2 四種群體GH基因的序列長(zhǎng)度(bp)

Tab.2 Sequence lengths of GH genes in four populations (bp)

2.2 太湖魴鲌與親本及太湖魴鲌F(tuán)2代GH基因序列與氨基酸序列對(duì)比分析

四種群體中太湖魴鲌F(tuán)2代GH基因序列最長(zhǎng), 比翹嘴鲌、三角魴及太湖魴鲌分別長(zhǎng)59、49和16bp。該差異的產(chǎn)生主要是由于各序列5′側(cè)翼區(qū)、內(nèi)含子及3′側(cè)翼區(qū)長(zhǎng)度存在不同程度的差異, 在所有外顯子處序列的長(zhǎng)度均無差異。以下圖例中翹嘴鲌、三角魴、太湖魴鲌、太湖魴鲌F(tuán)2代分別以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ表示。

5′側(cè)翼區(qū), 太湖魴鲌F(tuán)2代與三角魴在同一位置存在(AAT)7的微衛(wèi)星序列, 而太湖魴鲌與翹嘴鲌一致, 在相同位置均存在(AAT)8的微衛(wèi)星序列(圖1); 3′側(cè)翼區(qū), 太湖魴鲌F(tuán)2代與太湖魴鲌和三角魴微衛(wèi)星序列相同, 在相同位置存在(TTC)6T(TAA)6的微衛(wèi)星序列, 而翹嘴鲌存在(TTC)5T(TAA)8的微衛(wèi)星序列(圖1)。

圖1 5′及3′側(cè)翼區(qū)微衛(wèi)星序列比較

注; 陰影加粗部分為微衛(wèi)星序列, 下劃線處表示差異堿基及間隔堿基“T”

第一內(nèi)含子, 存在8bp以上的差異位點(diǎn)有2處, 8bp以下的差異位點(diǎn)有6處, 太湖魴鲌F(tuán)2代在該部分與太湖魴鲌的相似度為100%, 且兩者在第一內(nèi)含子處主要遺傳于三角魴; 第二內(nèi)含子, 共有16處差異位點(diǎn), 太湖魴鲌序列在其中10處只來自于父本三角魴, 2處來只自于母本翹嘴鲌, 有4處均不來源于親本, 可能是由于堿基的突變導(dǎo)致。在太湖魴鲌發(fā)生突變的其中1處位點(diǎn)及未發(fā)生突變的12處差異位點(diǎn)中, 太湖魴鲌F(tuán)2代在該13處位點(diǎn)均與其一致(圖2); 第三內(nèi)含子, 太湖魴鲌F(tuán)2代在全部16處差異位點(diǎn)中發(fā)生突變或缺失, 與太湖魴鲌、翹嘴鲌和三角魴均不一致(圖2); 第四內(nèi)含子, 太湖魴鲌F(tuán)2代有3處位點(diǎn)均發(fā)生了堿基的突變或缺失, 有2處分別來源于太湖魴鲌和三角魴。由此可判斷, 在第一、二內(nèi)含子中, 太湖魴鲌F(tuán)2代主要遺傳于太湖魴鲌及三角魴, 遺傳較為穩(wěn)定; 在第三、四內(nèi)含子中, 太湖魴鲌F(tuán)2代遺傳不穩(wěn)定, 發(fā)現(xiàn)了多個(gè)位點(diǎn)堿基的突變或缺失。另外, 在四種群體的內(nèi)含子中均未發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星序列。

四種群體的GH基因DNA序列均含完整閱讀框及起始密碼子、終止密碼子。根據(jù)圖3可以看出, 在第4、5外顯子中共有3處差異性位點(diǎn), 自交F2代在第4外顯子區(qū)有1處位點(diǎn)完全變異, 該位點(diǎn)位于密碼子第3位堿基, 但并未改變其編碼的氨基酸; 另外太湖魴鲌?jiān)诘?外顯子區(qū)有2處差異位點(diǎn), 該兩處位點(diǎn)均位于密碼子第二位堿基, 導(dǎo)致其編碼的氨基酸發(fā)生了改變, 太湖魴鲌F(tuán)2代及其祖父母在該2處編碼的氨基酸分別為谷氨酸、天冬氨酸, 而太湖魴鲌均為甘氨酸。

2.3 4個(gè)群體與其他魚類GH基因同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

利用MEGA 7.0軟件, 對(duì)本實(shí)驗(yàn)所獲得的太湖魴鲌與親本及太湖魴鲌F(tuán)2代, 從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的包括鱸形目、鯉形目、鲇形目在內(nèi)的共14種魚類GH編碼區(qū)核苷酸序列, 以構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹。圖4表明, 整個(gè)進(jìn)化樹共分為3個(gè)分支, F2代與鯉形目魚類遺傳距離相對(duì)最近, 其次為鲇形目, 以100%的置信度形成完整的一支, 鱸形目中的褐石斑魚單獨(dú)組成一支, 另外三種魚類以87%的置信度組成另一支, 由此組成魚類GH基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹。該進(jìn)化樹與同源性分析結(jié)果具有最大的一致性, 證明了對(duì)F2代進(jìn)行深度遺傳挖掘的重要性。

注; 下劃線處陰影加粗部分為差異堿基

圖3 外顯子及推導(dǎo)氨基酸序列分析比較

Fig.3 Comparison of exons and derived amino acid sequences

注; 下劃線處陰影加粗部分為差異堿基

圖4 4個(gè)群體與其他魚類系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 太湖魴鲌F(tuán)2代GH基因SNPs的篩選及基因結(jié)構(gòu)

經(jīng)太湖魴鲌自交后的F2代個(gè)體之間具有較為明顯的性狀分離現(xiàn)象(圖5), 翹嘴鲌與三角魴的各種形態(tài)特征組合在F2代中得到了較為全面的遺傳, BW、BL和BH等性狀在F2代群體中的差異較為顯著。對(duì)10尾太湖魴鲌F(tuán)2代個(gè)體(編號(hào)分別為S1—S10)的GH基因外顯子序列對(duì)比發(fā)現(xiàn), 第一外顯子中并未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn); 在第二外顯子中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)突變位點(diǎn), 即在86nt以1︰9的比例存在G/A轉(zhuǎn)換、135nt以1︰9的比例存在A/G轉(zhuǎn)換, 值得注意的是, 135nt突變堿基改變了氨基酸序列, 由天門冬氨酸(D)轉(zhuǎn)變?yōu)樘扉T冬酰胺(N); 第三外顯子存在一個(gè)突變位點(diǎn), 在104nt以1︰9的比例存在T/C轉(zhuǎn)換, 致使蘇氨酸(T)轉(zhuǎn)變?yōu)楫惲涟彼?I); 第四外顯子在90nt發(fā)現(xiàn)一個(gè)突變位點(diǎn), 以3︰7的比例存在A/G轉(zhuǎn)換, 未改變其氨基酸序列; 第五外顯子突變位點(diǎn)最多, 為3個(gè), 分別在19nt以1︰9的比例存在T/C轉(zhuǎn)換, 在238nt以4︰6的比例存在A/C轉(zhuǎn)換, 在247nt以4︰6的比例存在T/G轉(zhuǎn)換, 其中19nt突變堿基改變了氨基酸序列, 即脯氨酸(P)轉(zhuǎn)變?yōu)榻z氨酸(S)。差異氨基酸序列見圖6。

根據(jù)序列長(zhǎng)度及位點(diǎn)的變化情況, 制作了太湖魴鲌F(tuán)2代基因結(jié)構(gòu)的變異圖(圖7)。由圖可知, 經(jīng)自交后的F2代個(gè)體在GH基因編碼區(qū)序列長(zhǎng)度和核苷酸發(fā)生了顯著的變化, 從序列長(zhǎng)度來看, 只有3個(gè)個(gè)體與其親本相近, 其余7個(gè)個(gè)體序列長(zhǎng)度均遺傳于祖父母本, 這與2.3所描述結(jié)果具有一致性; 從編碼區(qū)核苷酸角度出發(fā), F2代發(fā)生突變的7處位點(diǎn)與其祖父母本在同一區(qū)域同一位置均發(fā)生變異, 因此太湖魴鲌通過自交GH基因結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了顯著性變化, 下一步對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析及組織表達(dá)分析, 探究基因結(jié)構(gòu)的變異對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及組織表達(dá)所帶來的影響。

圖5 F2代群體性狀分離圖

圖6 差異氨基酸序列對(duì)比

注; 下劃線處陰影加粗部分為差異氨基酸

圖7 GH基因結(jié)構(gòu)示意圖

注; 黃色、紅色、綠色、藍(lán)色分別代表堿基A、G、T、C

2.5 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

經(jīng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn), 10尾F2代GH基因均無跨膜結(jié)構(gòu), 且在成熟肽序列中均包含一個(gè)信號(hào)肽, 全部由22個(gè)氨基酸組成; 用NCBI的Conserved Domains (CD-Search)程序分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域表明, 均具有1個(gè)保守的蛋白結(jié)構(gòu)域, 且都位于第28—209位氨基酸處。由于S1、S3和S8個(gè)體分別在第49、85和150位氨基酸處發(fā)生了突變, 且突變位置均位于蛋白結(jié)構(gòu)域, 可信度(E-value)較氨基酸序列未突變個(gè)體(6.54e–72)發(fā)生了變化, 其中S3(7.65e–71)的E-value增加, 而S1和S8降低(均為4.48e–71)。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明, 突變個(gè)體S1、S3和S8二級(jí)結(jié)構(gòu)分別含52.86%、53.81%和52.38%的螺旋(helix), 43.81%、42.38%和44.76%的環(huán)(loop), 3.33%、3.81%和2.86%的鏈(strand), 而未突變個(gè)體二級(jí)結(jié)構(gòu)含52.86%的螺旋、43.33%的環(huán)(loop)和3.81%的鏈。由于氨基酸殘基的變化導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。

2.6 太湖魴鲌F(tuán)2代GH基因定量表達(dá)分析

實(shí)時(shí)定量分析結(jié)果表明, GH mRNA在所檢測(cè)的10個(gè)個(gè)體中均有表達(dá), 在S1中的轉(zhuǎn)錄水平最高, 按表達(dá)量大小其次為S2、S3、S10、S9, 在S4—S8中的表達(dá)量較低。我們將10個(gè)個(gè)體按體重分為兩組(小個(gè)體組: S3, S4, S7, S9, S10; 大個(gè)體組: S1, S2, S5, S6, S8), 小個(gè)體組體重平均值512.16g, 表達(dá)量0.238; 大個(gè)體組平均值825.08, 表達(dá)量1.087, 結(jié)果表明體重大的表達(dá)量高(圖8)。

3 討論

GH基因是魚類腦垂體中分泌的促進(jìn)生長(zhǎng)的單一亞基的蛋白激素(楊學(xué)明等, 2008), 它參與魚的生長(zhǎng)代謝, 能夠加速蛋白質(zhì)合成和脂類降解(Sakamoto, 2006; Sciara, 2006), 溫海深等(2002)報(bào)道了鯉魚生長(zhǎng)激素(cGH)RIA對(duì)鯉科魚類的測(cè)定具有良好的效果。本實(shí)驗(yàn)中, 太湖魴鲌及其親本和太湖魴鲌F(tuán)2代GH基因序列均包括五個(gè)外顯子、四個(gè)內(nèi)含子及5′側(cè)翼區(qū)和3′側(cè)翼區(qū), 其中外顯子長(zhǎng)度均具有一致性, F2代在第四外顯子中發(fā)生了G/A突變, 但未改變其編碼的氨基酸序列。相較于外顯子, 內(nèi)含子存在相對(duì)較大的差異。F2代內(nèi)含子長(zhǎng)度分別與翹嘴鲌、三角魴和太湖魴鲌具有9、4和31bp的差異, 且通過序列對(duì)比發(fā)現(xiàn), F2代的第一、二內(nèi)含子遺傳較為穩(wěn)定, 主要來源于太湖魴鲌及三角魴, 第三、四內(nèi)含子具有較多的堿基突變或缺失, 具有不穩(wěn)定遺傳。值得注意的是, 在5′側(cè)翼區(qū), 太湖魴鲌F(tuán)2代與祖父本三角魴在同一位置存在(AAT)7的微衛(wèi)星序列, 而太湖魴鲌與母本翹嘴鲌?jiān)谙嗤恢镁嬖?AAT)8的微衛(wèi)星序列; 在3′側(cè)翼區(qū), 太湖魴鲌F(tuán)2代、太湖魴鲌與父本三角魴一致, 在相同位置存在(TTC)6T(TAA)6的微衛(wèi)星序列, 而母本翹嘴鲌存在(TTC)5T(TAA)8的微衛(wèi)星序列。預(yù)測(cè)太湖魴鲌F(tuán)2代GH基因位于兩端的微衛(wèi)星位點(diǎn)具有多態(tài)性, 與生長(zhǎng)相關(guān)性狀之間的關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)。

圖8 F2代大、小個(gè)體組中GH mRNA的表達(dá)

本研究對(duì)3個(gè)目14種魚類進(jìn)行同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn), 兩者結(jié)果具有最高的一致性, 符合常規(guī)生物學(xué)上物種親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近程度, F2代與祖父母的遺傳距離稍近于親本。由于第五外顯子出現(xiàn)了兩處堿基突變, F2代在保守的蛋白結(jié)構(gòu)域與親本具有兩處氨基酸殘基的差異(分別處于176nt和205nt), 同時(shí)也在氨基酸序列176nt發(fā)現(xiàn)一處與鰱魚之間的差異位點(diǎn), 且僅有一處; F2代在信號(hào)肽和保守蛋白區(qū)域均發(fā)現(xiàn)一處與草魚具有差異性的氨基酸殘基, 發(fā)生了由纈氨酸-甘氨酸、精氨酸-甘氨酸的變化; 在與鱸形目和鲇形目的比較中, F2代與其氨基酸序列的差異主要集中在保守蛋白區(qū)域109nt至184nt之間, 相似性較低, 特別是與河川沙塘鱧僅有43.60%的相似度。該結(jié)果對(duì)F2代進(jìn)行深度遺傳挖掘具有重要意義。

陳雪峰(2010)等采用了無需特殊儀器的Tetra- primers ARMS與PCR-RFLP法對(duì)吉富羅非魚IGF2基因進(jìn)行了SNPs的檢測(cè), 共得到11處SNP位點(diǎn), 8處位于內(nèi)含子中, 3處位于外顯子中, 且得到內(nèi)含子SNPs的突變率高于外顯子的結(jié)論。本文通過篩選得到體型具有顯著差異的太湖魴鲌F(tuán)2代共10尾, 對(duì)其GH基因外顯子序列進(jìn)行分析。結(jié)果顯示, 在第二、三、四和五外顯子中共得到7處SNP位點(diǎn), 其中位于第二、三和五外顯子中的3處突變位點(diǎn)使氨基酸殘基發(fā)生變異, 導(dǎo)致S1、S3和S8個(gè)體發(fā)生了序列變化。根據(jù)其變化情況, 我們對(duì)GH基因蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè), 結(jié)果發(fā)現(xiàn)變異后的氨基酸殘基改變了蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu), 使突變個(gè)體及未突變個(gè)體間產(chǎn)生不同的helix、loop和strand的組成占比。我們將10個(gè)F2代個(gè)體按體重分為小個(gè)體組和大個(gè)體組, 分析發(fā)現(xiàn), GH mRNA在大個(gè)體組中的轉(zhuǎn)錄水平較高, 主要是由于在大個(gè)體組中S1發(fā)生了氨基酸殘基的變化(天冬氨酸—天冬酰胺), 導(dǎo)致其產(chǎn)生了最高的轉(zhuǎn)錄水平, 使大個(gè)體組整體轉(zhuǎn)錄水平升高, 該結(jié)果可為以后的分子輔助標(biāo)記育種研究提供理論基礎(chǔ)。本研究所取魚類均為同一時(shí)期, 且所取組織相同, 所得結(jié)論具有一定得參考意義和理論價(jià)值。

4 結(jié)論

本研究利用分子生物學(xué)技術(shù), 克隆獲得三角魴、太湖魴鲌、太湖魴鲌F(tuán)2代的GH基因全長(zhǎng)序列, 從分子角度分析其遺傳差異性; 單獨(dú)對(duì)太湖魴鲌F(tuán)2代GH基因進(jìn)行SNPs的篩選以及對(duì)GH基因蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè), 并進(jìn)行了組織表達(dá)分析, 結(jié)果表明太湖魴鲌自交后引起的氨基酸殘基的改變導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變及基因表達(dá)產(chǎn)生顯著變化。

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STRUCTURE, PHYLOGENY AND TISSUE DISTRIBUTION OF GH IN♀×♂

LIU Jia-Lin1, 2, JIA Yong-Yi1, LIU Shi-Li1, ZHENG Jian-Bo1, CHI Mei-Li1, CHENG Shun1, LI Fei1, YIN Shao-Wu2, GU Zhi-Min1

(1. Key Laboratory of Healthy Freshwater Aquaculture of Ministry of Agriculture and Rural Development / Key Laboratory of Freshwater Aquatic Animal Genetic and Breeding of Zhejiang Province, Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries, Huzhou 313001, China; 2. School of Life Science, Nanjing Normal University, Nanjing 210023, China)

Using polymerase chain reaction (PCR) and T-A cloning technology, we successfully obtained complete sequences of growth hormone (GH) gene with complete open reading frames from complete genomic DNA from three fish populations,♀ ×♂ (×), and the F2of×. The total length of the sequence was 6009, 6042, and 6058bp, respectively, and the length of the transcription unit was 2049, 2014, and 2045bp, respectively. The GH gene sequence of the three populations includes five exons, four introns, 5′UTR (untranslated region) and 3′UTR. All of them encoded 633bp amino acid sequence and 210 amino acids. The homology and phylogeny analysis on 14 fish species from 3 orders showed that the genetic distance between the F2and its grandparents was closer than that of their parents. Seven SNPs (single nucleotide polymorphism) were obtained from 10 individuals of the F2, from which three mutations were observed causing significant changes in amino acid sequence. The analysis of protein structure showed that the mutated amino acid residue resulted in the change of protein secondary structure. We divided the 10 individuals into small and large body groups according to their body weight. Through tissue expression analysis, we found that the individuals in the large group had higher transcription level, and further analysis found that their amino acid residues were different.

♀×♂; intergeneric cross; growth hormone; cloning; SNPs; expression analysis

* 浙江省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目, 2016C02055-1號(hào)。劉加林, 碩士研究生, E-mail: 1961954694@qq.com

顧志敏, 研究員, E-mail: guzhimin2006@163.com

2020-01-06,

2020-05-24

Q789; S965

10.11693/hyhz20200100006