劉沖英，陳子龍，王 睿，李 瑾，陳 艷，張麗華，趙 鵬*

(1.陜西中醫(yī)藥大學藥學院 陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室，陜西 咸陽 712046; 2.渭南市食品藥品檢驗所，陜西 渭南 714000；3.渭南市市場監(jiān)督管理局，陜西 渭南 714000)

中藥地黃(RehmanniaglutinosaLibosch.)是玄參科植物地黃的根，根據(jù)其入藥形式可分為鮮地黃、生地黃、熟地黃、地黃炭等。地黃最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》中，具有滋陰、補血、降血糖等功效，被列為補益類中藥的上品。此外，地黃也可作為保健品，用途廣泛[1]。

多糖是地黃的重要活性成分之一，具有抗氧化[2]、調(diào)節(jié)血糖和血脂[3]、增強免疫功能[4-5]、促進造血功能[6-7]等多種生物活性作用[8-9]。但地黃粗多糖中蛋白質(zhì)雜質(zhì)的存在極大地影響了多糖的生物活性，使多糖質(zhì)量難以控制。目前，常用的多糖脫蛋白方法有Sevage法、鹽酸法和三氯乙酸法等[10-13]，這些方法存在多糖保留率低、有機溶劑使用量大等缺點。因此，亟需開發(fā)適用于地黃多糖脫蛋白的工藝。生物酶法脫蛋白由于具有特異性較強、效率高、酶用量少、污染小且不會對多糖的結(jié)構(gòu)造成破壞等優(yōu)點，受到了研究者的廣泛關(guān)注[14-15]。基于此，作者以蛋白脫除率和多糖保留率為評價指標，在單因素實驗的基礎上，采用響應面法優(yōu)化地黃多糖的酶法脫蛋白工藝條件，以期為進一步深入研究地黃多糖奠定基礎。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

地黃粗多糖，自制。

小牛血清白蛋白，生物級，上海麥克林生化科技有限公司；考馬斯亮藍G250(分析純)、木瓜蛋白酶(活力>2400 U·mg-1)，百靈威科技有限公司；無水乙醇、乙醚、苯酚、濃硫酸、三氯甲烷、正丁醇等均為國產(chǎn)分析純。

HHS型恒溫水浴鍋，鞏義予華儀器廠；AL204型分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；UV-265型紫外分光光度計，日本島津公司。

1.2 地黃多糖脫蛋白

配制15 mg·mL-1的地黃粗多糖溶液50 mL，加入一定量的木瓜蛋白酶，置于一定溫度的水浴中，攪拌下保溫一段時間；3 000 r·min-1離心10 min，棄去上清液，濃縮后醇沉，過濾，收集濾餅，烘干，即得脫蛋白的地黃多糖。

采用考馬斯亮藍染色法[16]測定地黃多糖中蛋白含量，蛋白脫除率按式(1)計算：

(1)

式中：c0、c1分別為地黃多糖在脫蛋白前、后的蛋白含量。

采用苯酚硫酸法[17]測定地黃多糖含量，多糖保留率按式(2)計算:

(2)

式中：M0、M1分別為脫蛋白前、后地黃多糖含量。

1.3 脫蛋白工藝優(yōu)化

以木瓜蛋白酶用量(以地黃多糖質(zhì)量計)、脫蛋白溫度、pH值、脫蛋白時間為考察因素,以蛋白脫除率和多糖保留率為評價指標，進行單因素實驗。 在單因素實驗的基礎上，選擇木瓜蛋白酶用量(X1)、脫蛋白溫度(X2)、脫蛋白時間(X3)進行3因素3水平的響應面實驗。由于在各因素水平下，多糖保留率變化不大，因此，選擇地黃多糖的蛋白脫除率為評價指標。響應面實驗的因素與水平見表1。

表1 因素與水平

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 木瓜蛋白酶用量

在脫蛋白溫度為50 ℃、pH值為7、脫蛋白時間為75 min的條件下，考察木瓜蛋白酶用量對地黃多糖脫蛋白效果的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 木瓜蛋白酶用量對蛋白脫除率及多糖保留率的影響

由圖1可知，隨著木瓜蛋白酶用量的增加，地黃多糖的蛋白脫除率呈上升趨勢；當木瓜蛋白酶用量超過1.0%后，蛋白脫除率幾乎不變。在整個過程中，多糖保留率變化不大。因此，確定適宜的木瓜蛋白酶用量為1.0%。

2.1.2 脫蛋白溫度

在木瓜蛋白酶用量為1.0%、其它條件同2.1.1下，考察脫蛋白溫度對地黃多糖脫蛋白效果的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 脫蛋白溫度對蛋白脫除率及多糖保留率的影響

由圖2可知，隨著脫蛋白溫度的升高，地黃多糖的蛋白脫除率呈上升趨勢，當脫蛋白溫度達到60 ℃時，蛋白脫除率達到最高；繼續(xù)升高脫蛋白溫度，蛋白脫除率呈下降趨勢。說明，溫度的升高有助于提高木瓜蛋白酶的活性，從而有效提高了蛋白脫除率；而溫度過高時，會造成部分酶變性失活，降低了木瓜蛋白酶降解蛋白的能力。在整個過程中，多糖保留率變化不大。因此，確定適宜的脫蛋白溫度為60 ℃。

2.1.3 pH值

在脫蛋白溫度為60 ℃、其它條件同2.1.2下，考察pH值對地黃多糖脫蛋白效果的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 pH值對蛋白脫除率及多糖保留率的影響

由圖3可知，隨著pH值的增大，地黃多糖的蛋白脫除率和多糖保留率均呈先上升后下降趨勢，當pH值為7時，地黃多糖的蛋白脫除率和多糖保留率均最高。這是因為，在中性環(huán)境中木瓜蛋白酶的活性最高，堿性環(huán)境會破壞酶的活性從而造成蛋白脫除率下降；此外，酸堿環(huán)境對多糖保留率的影響均較大。因此，確定適宜的pH值為7。

2.1.4 脫蛋白時間

在pH值為7、其它條件同2.1.3下，考察脫蛋白時間對地黃多糖脫蛋白效果的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 脫蛋白時間對蛋白脫除率及多糖保留率的影響

由圖4可知，隨著脫蛋白時間的延長，地黃多糖的蛋白脫除率呈上升趨勢，當脫蛋白時間為105 min時，蛋白脫除率最高；繼續(xù)延長脫蛋白時間，蛋白脫除率呈下降趨勢。在整個過程中，多糖保留率變化不大。因此，確定適宜的脫蛋白時間為105 min。

2.2 響應面實驗結(jié)果

2.2.1 響應面實驗方案設計與結(jié)果(表2)

表2 響應面實驗方案設計與結(jié)果

對回歸模型方程進行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 方差分析

2.2.2 響應面圖和等高線圖分析(圖5)

由圖5a可知，木瓜蛋白酶用量與脫蛋白溫度的等高線的形狀趨近于圓形，這說明兩者之間的交互作用影響較小，相對而言，脫蛋白溫度的曲線較為陡峭，其對蛋白脫除率的影響較大。由圖5b可知，木瓜蛋白酶用量與脫蛋白時間的交互作用影響顯著，且脫蛋白時間的軸向等高線較為密集，木瓜蛋白酶用量的軸向等高線相對稀疏，說明脫蛋白時間對蛋白脫除率的影響較大。由圖5c可知，脫蛋白溫度與脫蛋白時間的交互作用影響較小，且脫蛋白時間的軸向等高線較稀疏，而脫蛋白溫度的軸向等高線較密，說明脫蛋白溫度對蛋白脫除率的影響較大。對擬合得到的二次多項回歸方程進行極值分析，兩邊取一階偏導為零[18]，可知：X1=0.17、X2=0.373、X3=0.14，即預測地黃多糖脫蛋白的最優(yōu)工藝條件為：木瓜蛋白酶用量1.043%、脫蛋白溫度61.87 ℃、脫蛋白時間102.9 min，預測蛋白脫除率為68.87%。

圖5 各因素交互作用對蛋白脫除率影響的響應面圖和等高線圖

2.2.3 工藝驗證

考慮到工藝的可操作性，將模型預測得到的工藝條件微調(diào)為：木瓜蛋白酶用量1.05%、脫蛋白溫度62.0 ℃、pH值7、脫蛋白時間103 min，在此條件下，進行了3組平行實驗，地黃多糖的蛋白脫除率平均值為68.53%，多糖保留率為87.72%，與模型預測值接近。說明采用響應面法優(yōu)化得到的工藝條件真實可靠。鑒于單純木瓜蛋白酶法對地黃多糖的蛋白脫除率較低，為進一步降低地黃多糖的蛋白含量，又采用Sevage法對地黃多糖進行了2次脫蛋白處理，結(jié)果顯示，地黃多糖的蛋白脫除率可達86.71%，多糖保留率為77.45%。說明，采用木瓜蛋白酶法結(jié)合Sevage法進行地黃多糖脫蛋白的工藝路線更加合理。

3 結(jié)論

以蛋白脫除率和多糖保留率為評價指標，在單因素實驗的基礎上，采用響應面法優(yōu)化了地黃多糖的酶法脫蛋白工藝條件。確定了酶法脫蛋白的最佳工藝條件為：木瓜蛋白酶用量1.05%、脫蛋白溫度62.0 ℃、pH值7、脫蛋白時間103 min，采用酶法結(jié)合2次Sevage法進行脫蛋白處理，地黃多糖的蛋白脫除率可達86.71%，多糖保留率為77.45%。木瓜蛋白酶法結(jié)合Sevage法是一種較好的地黃多糖脫蛋白方法，具有蛋白脫除率高、多糖保留率高、操作簡單、污染較小等優(yōu)點，為深入研究地黃多糖奠定了基礎。