程曜峰，冷 鳳，孫丙林，張 煒*，張雪霞*

(1.華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司 微生物藥物國家工程研究中心 河北省工業(yè)微生物代謝工程技術研究中心，河北 石家莊 050015； 2.華北制藥集團華勝有限責任公司，河北 石家莊 050015)

咪唑立賓(Mizoribine，MZR)，商品名為布累迪寧，是1971年從真菌Eupenicilliumbrefedianum的培養(yǎng)液中分離得到的一種咪唑類核苷[1]，其分子式為C9H13N3O6，化學名為5-羥基-1-β-D-呋喃糖基-1H咪唑-4-羧酸胺，呈白色或微帶黃色的結(jié)晶粉末[2]。咪唑立賓早期作為抗真菌藥物開發(fā)，后期研究發(fā)現(xiàn)其具有免疫抑制效應和抗腫瘤作用[3]。咪唑立賓作為兼抗腫瘤和抗排斥雙重特性的免疫抑制劑，臨床多應用于腎移植術后患者的治療，在降低排斥反應發(fā)生的同時，預防、治療腎移植術后惡性腫瘤，從而提高腎移植術后患者的長期存活率[4]。相比于其它免疫抑制劑，咪唑立賓還具有骨髓抑制作用弱、消化系統(tǒng)不良反應小等優(yōu)點[5]。此外，咪唑立賓臨床上也可用于治療狼瘡性腎炎、類風濕性關節(jié)炎[6]及腎病綜合征[7]等自身免疫性疾病。

咪唑立賓主要通過發(fā)酵法生產(chǎn)，其發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)過濾、提取、精制、脫色、結(jié)晶等過程得到產(chǎn)品。傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝所得產(chǎn)品多為咪唑立賓一水合物，該化合物性質(zhì)不穩(wěn)定，不便于儲存和運輸。為提高咪唑立賓的穩(wěn)定性，專利[8]公開了一種將咪唑立賓一水合物加入到乙醇中加熱回流制備無水咪唑立賓的方法，所得無水咪唑立賓的性質(zhì)穩(wěn)定。但該方法所得產(chǎn)品晶粒細小，制劑分裝困難，不利于工業(yè)生產(chǎn)。鑒于此，作者對咪唑立賓的結(jié)晶工藝進行優(yōu)化，探究抗溶劑種類、溶液初始濃度、抗溶劑滴加速度及抗溶劑加量對咪唑立賓結(jié)晶純度、堆密度、收率和產(chǎn)品穩(wěn)定性的影響。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

咪唑立賓粗品(純度85%)，華北制藥集團華勝有限責任公司；甲醇、乙醇、丙酮，分析純，天津科密歐化學試劑有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

高效液相色譜儀(SPD-M20A 型紫外檢測器，LC-20AT型泵，SIL-20A型自動進樣器，CTO-10AS型柱溫箱)，日本Shimadzu公司；OptiMax 1001型結(jié)晶器(反應釜 500 mL)， Mettler-Toledo公司；Leica DM500-ICC50型顯微鏡。

1.2 方法

將咪唑立賓粗品溶解于一定體積、一定溫度的純化水中制成溶液，以不同滴加速度加入一定量抗溶劑，抗溶劑加量為水溶液體積的8～12倍；加料結(jié)束后養(yǎng)晶3～6 h，過濾，用抗溶劑洗滌濾餅，干燥，即得咪唑立賓結(jié)晶產(chǎn)品。

對咪唑立賓結(jié)晶過程中抗溶劑種類、溶液初始濃度、抗溶劑滴加速度及抗溶劑加量進行優(yōu)化，以提高咪唑立賓結(jié)晶純度、堆密度和收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)晶工藝優(yōu)化

2.1.1 抗溶劑種類選擇

配制濃度為0.5 g·mL-1的咪唑立賓水溶液，分別以甲醇、乙醇、丙酮為抗溶劑進行結(jié)晶，抗溶劑加量為咪唑立賓水溶液體積的10倍，滴加速度為6 BV·h-1，滴加完畢后養(yǎng)晶4 h，考察抗溶劑種類對結(jié)晶效果的影響，結(jié)果見表1。

表1 抗溶劑種類對結(jié)晶效果的影響

由表1可知，使用3種抗溶劑均可以得到結(jié)晶產(chǎn)品。綜合考慮，以乙醇為抗溶劑時，結(jié)晶產(chǎn)品可獲得更好的純度、堆密度和收率。

2.1.2 溶液初始濃度和抗溶劑滴加速度選擇

在結(jié)晶過程中，抗溶劑加量過大會形成超過飽和微環(huán)境，容易引發(fā)爆發(fā)成核，致使晶體細小、晶體團聚、溶劑和雜質(zhì)包容在晶簇中，從而影響產(chǎn)品質(zhì)量。降低體系初始濃度可以降低局部的過飽和度，減少爆發(fā)成核帶來的負面影響；而過低的初始濃度不僅會增大抗溶劑的消耗量，也會導致收率下降。因此，尋找恰當?shù)某跏紳舛仁强刂瓶谷軇┙Y(jié)晶過程的關鍵之一。

抗溶劑與結(jié)晶液的快速混合有利于迅速降低局部的過飽和度，減少爆發(fā)成核的發(fā)生率。在結(jié)晶設備參數(shù)固定的情況下，抗溶劑滴加速度是影響溶劑混合的關鍵。對溶液初始濃度和抗溶劑滴加速度兩個參數(shù)組合進行優(yōu)化，結(jié)果見表2。

表2 溶液初始濃度和抗溶劑滴加速度對結(jié)晶效果的影響

由表2可知，溶液初始濃度高、抗溶劑滴加速度快時收率較高，但純度和堆密度呈下降的趨勢。咪唑立賓產(chǎn)品質(zhì)量要求純度盡量高，堆密度盡量大。從生產(chǎn)成本控制方面考慮，收率應盡量高一些。綜合考慮，在滿足質(zhì)量指標要求的前提下，選擇溶液初始濃度為0.7 g·mL-1，抗溶劑滴加速度為5 BV·h-1。

2.1.3 抗溶劑加量選擇

在溶液初始濃度為0.7 g·mL-1、抗溶劑滴加速度為5 BV·h-1的條件下，分別采用8 BV、10 BV、12 BV的抗溶劑加量進行結(jié)晶實驗，結(jié)果見表3。

表3 抗溶劑加量對結(jié)晶效果的影響

由表3可知，抗溶劑加量主要影響產(chǎn)品收率，對純度和堆密度影響較小。綜合考慮原材料的成本與產(chǎn)品收率，選擇抗溶劑加量為12 BV最為經(jīng)濟。

2.2 優(yōu)化工藝放大驗證

在優(yōu)化工藝條件下進行了3批工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)工藝驗證。稱取14 kg咪唑立賓粗品溶解于20 L純化水中，配制濃度為0.7 g·mL-1的咪唑立賓水溶液。以工業(yè)乙醇為抗溶劑，抗溶劑加量為咪唑立賓水溶液體積的12倍，滴加速度為5 BV·h-1，滴加完畢后養(yǎng)晶4 h，過濾、洗滌、干燥得咪唑立賓結(jié)晶產(chǎn)品，結(jié)果見表4。

表4 咪唑立賓結(jié)晶工藝驗證結(jié)果

生產(chǎn)工藝驗證所得咪唑立賓晶體與重結(jié)晶前咪唑立賓晶體相比，晶體外觀發(fā)生明顯變化，由重結(jié)晶前的塊狀晶體變?yōu)獒槧罹w(圖1)。

圖1 咪唑立賓重結(jié)晶前(a)后(b)晶體的顯微照片

最佳工藝條件下生產(chǎn)放大所得結(jié)晶產(chǎn)品的室溫長期穩(wěn)定性檢測結(jié)果見表5。

表5 室溫長期穩(wěn)定性檢測結(jié)果

由表5可知，生產(chǎn)放大所得結(jié)晶產(chǎn)品室溫存放36個月，純度仍達到99.6%，僅下降0.2%，表明結(jié)晶產(chǎn)品可長期存放，穩(wěn)定性好。

優(yōu)化的咪唑立賓粗品結(jié)晶工藝操作簡單、結(jié)晶收率高，所制備的產(chǎn)品純度高、堆密度較大、穩(wěn)定性好，可滿足制劑工藝要求。

3 結(jié)論

對咪唑立賓的結(jié)晶工藝進行優(yōu)化，探究了抗溶劑種類、溶液初始濃度、抗溶劑滴加速度及抗溶劑加量對咪唑立賓結(jié)晶純度、堆密度、收率和產(chǎn)品穩(wěn)定性的影響。確定最佳結(jié)晶工藝為：以乙醇為抗溶劑、溶液初始濃度0.7 g·mL-1、抗溶劑滴加速度5 BV·h-1、抗溶劑加量為咪唑立賓水溶液體積的12倍(12 BV)。該結(jié)晶工藝所得產(chǎn)品純度高、雜質(zhì)少、堆密度較大、穩(wěn)定性好，適合工業(yè)化生產(chǎn)，有利于長期儲存和制劑分裝，對此類藥品的工業(yè)結(jié)晶有較好的應用價值。