謝言射，徐志謙，蔡更元，吳珍芳，洪林君，黃思秀

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/國(guó)家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642)

豬精液冷凍保存技術(shù)是利用液氮(-196 ℃)做為冷源，在超低溫環(huán)境下冷凍處理豬精液，完全抑制其精子的生理代謝活動(dòng)，達(dá)到長(zhǎng)期保存豬精液的目的。冷凍保存技術(shù)對(duì)保存優(yōu)質(zhì)遺傳資源、提高種公豬利用率、防止疾病傳播、推動(dòng)聯(lián)和育種、加速中國(guó)生豬產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型等方面具有重大作用。然而，中國(guó)豬精液冷凍保存技術(shù)起步較晚，多以引進(jìn)國(guó)外相關(guān)設(shè)備和技術(shù)為基礎(chǔ)，目前雖然在精液稀釋液、冷凍保護(hù)劑、冷凍程序等方面的研究和優(yōu)化中取得了一定成績(jī)，但精液冷凍保存、冷凍損傷等的機(jī)理尚未完全清楚，仍需要進(jìn)一步探究。本文結(jié)合豬精液冷凍保存技術(shù)的發(fā)展簡(jiǎn)況、影響豬精液冷凍過程精子質(zhì)量的因素、豬精液稀釋液的機(jī)理，對(duì)精液冷凍保存的最新研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，為相關(guān)研究以及生產(chǎn)實(shí)際應(yīng)用提供理論參考。

1 豬精液冷凍保存技術(shù)的發(fā)展簡(jiǎn)況

精子是第一個(gè)成功冷凍保存的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。1949年P(guān)olge等[1]在試驗(yàn)中偶然發(fā)現(xiàn)甘油對(duì)冷凍保存的影響，并通過后續(xù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)含有20%甘油的精液稀釋液能使在-80 ℃下短暫冷凍的家禽精液完全恢復(fù)活力，這標(biāo)志著血細(xì)胞、精子以及其他組織、器官冷凍保存方法的開始。精液的第一次冷凍保存也為低溫生物學(xué)理論的研究提供了動(dòng)力，尤其是旨在發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在低溫條件下受損或死亡原因的研究。1956年，Polge等[2]對(duì)不同哺乳動(dòng)物的精液進(jìn)行冷凍保存，發(fā)現(xiàn)不同哺乳動(dòng)物精液冷凍保存的最適甘油濃度不同，其中7.5%甘油的稀釋液對(duì)豬精液的毒性最小，豬精液在解凍后仍存在活性但沒有受精能力。1970年以后，豬精液冷凍技術(shù)發(fā)展較快。1975年P(guān)ursel等[3]用顆粒冷凍法冷凍保存豬精液，使用解凍后精液對(duì)26頭母豬進(jìn)行人工授精，其中22頭母豬受孕且19頭母豬的受精卵發(fā)育正常。 1975年Westendorf等[4]用細(xì)管冷凍精液對(duì)30頭青年母豬和經(jīng)產(chǎn)母豬進(jìn)行人工授精，受胎率高達(dá)70%。此后，各國(guó)研究人員對(duì)不同方面的豬精液冷凍保存技術(shù)進(jìn)行研究，包括稀釋液配方、各種冷凍保護(hù)劑的選擇、冷凍程序的優(yōu)化、冷凍損傷機(jī)理等。而中國(guó)豬精液冷凍保存技術(shù)研究起步較晚，直到1974 年才由廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所首先開展研究，1980年以后開始從國(guó)外引進(jìn)生產(chǎn)冷凍精液的設(shè)備和技術(shù)，精液冷凍保存技術(shù)進(jìn)入快速發(fā)展階段。1978年11月至1980年12月，王丕建等[5]將葡萄糖4 g、蔗糖1.2 g、新鮮牛奶30 mL、新鮮蛋黃10 mL、甘油3 mL、蒸餾水57 mL配成的稀釋液按1:1比例稀釋豬精液，解凍后人工授精132頭母豬，情期受胎率51.92%，平均每窩產(chǎn)仔數(shù)10.19頭。1991年滕鐘秀等[6]通過分析精子活率、精子復(fù)蘇率、頂體完整率、乳酸脫氫酶活性和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性等5個(gè)方面得出含2%甘油的精液稀釋液保存效果最佳。自1990起，雖然許多研究人員在精液稀釋液、冷凍保護(hù)劑、冷凍程序等方面的研究和優(yōu)化中取得了一定成績(jī)，但對(duì)冷凍保存、冷凍損傷等的機(jī)理尚未完全清楚，仍需要進(jìn)一步的探究。

2 影響豬冷凍精液質(zhì)量的因素

2.1 冷凍環(huán)境對(duì)精子的影響

2.2 冷凍過程對(duì)精子的氧化應(yīng)激

精子內(nèi)存在著復(fù)雜的氧化還原體系，通過維持精子內(nèi)抗氧化物質(zhì)和氧化物質(zhì)之間的相互作用，從而影響精子中脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的水平。精液冷凍保存過程中，精子中存在的某些有效物質(zhì)失活，打破了抗氧化物質(zhì)和氧化物質(zhì)之間的平衡狀態(tài)，從而產(chǎn)生大量的活性氧物質(zhì)(reactive oxygen species，ROS)，這是影響精液長(zhǎng)期冷凍保存的一個(gè)重要因素。而ROS在某些水平上又是細(xì)胞信號(hào)、線粒體功能和免疫等過程所必需的[18]，例如豬精子主要能量來源的線粒體氧化磷酸化(果糖)過程中[19]，還原性谷胱甘肽參與精子果糖的分解[20]，堿性磷酸酶參與精子內(nèi)果糖的合成與激活[21]。但隨著保存過程的進(jìn)行，用于果糖激活的抗氧化酶的作用和氧化磷酸化的電子傳遞鏈將促進(jìn)ROS的產(chǎn)生。當(dāng)ROS含量超過生物固有的抗氧化能力時(shí)就會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，由于豬精子細(xì)胞膜中多不飽和脂肪酸含量高，抗氧化能力有限，所以其對(duì)氧化應(yīng)激更為敏感[22-23]。這些ROS通過精子膜上磷脂的氧化反應(yīng)改變膜的功能結(jié)構(gòu)，從而破壞精子的功能。同時(shí)，ROS還能破壞精子DNA，導(dǎo)致精子受精能力被削弱，從而影響精液體外保存效果。此外，ROS可抑制酶類活性或使酶失活，使ROS不能被及時(shí)清除，氧化損傷加深，甚至導(dǎo)致精子凋亡。而且隨著精液保存的進(jìn)行，脂質(zhì)在自由基的作用下發(fā)生過氧化反應(yīng)，氧化終產(chǎn)物為丙二醛(Malondialdehyde ，MDA)，MDA水平隨著精液保存時(shí)間的增加逐漸升高，并通過與蛋白質(zhì)的交聯(lián)作用進(jìn)一步損害精子細(xì)胞的功能[24-25]。

2.3 冷凍速率對(duì)精子的影響

精子的損傷程度與冷凍速率有關(guān)，豬精子的最佳冷凍速率為0.1 ℃/min[26]，當(dāng)冷凍速率過低(緩慢冷凍損傷)或冷凍速率過高(快速冷凍損傷)時(shí)細(xì)胞存活率降低[27]。當(dāng)細(xì)胞緩慢冷凍時(shí)，細(xì)胞脫水最為嚴(yán)重，細(xì)胞內(nèi)的鹽濃度最大，對(duì)細(xì)胞本身造成巨大的損害。當(dāng)冷凍速率增加時(shí)細(xì)胞內(nèi)脫水減少，細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度減少，細(xì)胞收縮減少。然而，當(dāng)冷凍速率過快時(shí)，脫水速度可能不夠快，無法防止細(xì)胞內(nèi)的冰核形成[27-29]，產(chǎn)生冰核作用，引起一系列損害。一般來說根據(jù)含水量、細(xì)胞的大小和形狀以及胞質(zhì)膜的透水系數(shù)，每個(gè)細(xì)胞都將有一個(gè)特定的臨界冷凍速率范圍，這意味著對(duì)于單個(gè)動(dòng)物的精子來說，最佳冷凍速率應(yīng)該是確定的，但不同的公豬在相同冷凍速率處理后的精子存活率有很大差異。2005年，Holt等[30]通過對(duì)大白、長(zhǎng)白、杜洛克三個(gè)品種共129頭公豬進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在相同冷凍速率下長(zhǎng)白豬的精子解凍后質(zhì)量最好，為了獲得更準(zhǔn)確的結(jié)果，Holt等用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)對(duì)解凍后精子質(zhì)量好的公豬DNA和解凍后精子質(zhì)量差的公豬DNA進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)與解凍后精子質(zhì)量有關(guān)的DNA圖譜中存在16條有顯著差異的條帶，表明公豬個(gè)體之間的基因組差異與解凍后精子質(zhì)量相關(guān)，這意味著仍存在研究評(píng)估其他更快冷凍速率的可行性。

2.4 其他影響豬精液冷凍保存的因素

2.4.1 酸堿度對(duì)精子質(zhì)量的影響 射精后，精子的酸堿度(pH)約為7.4[31]。隨著冷凍的進(jìn)行，細(xì)胞脫水，某些細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度上升達(dá)到飽和，產(chǎn)生結(jié)晶。這種選擇性沉淀將引起pH的下降，并通過損傷蛋白質(zhì)或改變脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)從而嚴(yán)重影響膜的穩(wěn)定性。除此之外，低的pH將引起精子凝集，甚至激活pH依賴的蛋白水解酶，如半胱天冬氨酸蛋白酶，能夠?qū)е录?xì)胞過早凋亡[32]。此外，外部酸堿度可能影響精子的鞭毛運(yùn)動(dòng)，1993年Gatti等[33]通過采集精液并在不同pH培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)射精后精子在精漿中具有高度的運(yùn)動(dòng)性，在pH5的培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 min，精子運(yùn)動(dòng)率僅為5%；在pH7的培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 min，精子運(yùn)動(dòng)率超過70%；在pH7～9的培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 min，所有運(yùn)動(dòng)精子都呈前向運(yùn)動(dòng)，鞭毛搏動(dòng)頻率平均為15～20 Hz。隨著pH的下降，鞭毛搏動(dòng)頻率下降且越來越不規(guī)律。

2.4.2 細(xì)菌對(duì)精子質(zhì)量的影響 健康公豬的精液基本上都會(huì)被細(xì)菌感染，細(xì)菌含量高達(dá)109個(gè)/mL。這些細(xì)菌部分屬于內(nèi)源性污染，公豬的包皮、尿道、外生殖器及泌尿生殖感染等因素均可能導(dǎo)致精液被細(xì)菌污染，而多數(shù)屬于外源性污染，因?yàn)椴删骶?、稀釋液及保存環(huán)境等人為過程中缺乏相應(yīng)的衛(wèi)生條件導(dǎo)致精液被細(xì)菌污染，尤其在高溫季節(jié)病原菌易滋生。但在精液中檢測(cè)到的大部分細(xì)菌都是無致病性的，因?yàn)榇菩陨车雷陨磉M(jìn)化出了一種對(duì)抗精液中細(xì)菌的防御機(jī)制，所以在自然交配的情況下，生殖性能幾乎沒有受到影響。然而，當(dāng)使用人工授精時(shí)，細(xì)菌能在稀釋后的精液中生長(zhǎng)繁殖，這些精液在雌性生殖道沉積后可能導(dǎo)致胚胎或胎兒死亡、子宮內(nèi)膜炎、全身感染等問題[34]。冷凍保存過程中細(xì)菌等病原菌對(duì)豬精子質(zhì)量產(chǎn)生的較大影響主要體現(xiàn)在誘導(dǎo)精子發(fā)生凝集現(xiàn)象[35]，降低精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)等質(zhì)量特性，誘發(fā)破壞精子頂體完整性，抑制精子特異性蛋白質(zhì)磷酸化水平[36]，降低精液 pH 以及母豬產(chǎn)仔數(shù)等生產(chǎn)性能[37]。除此之外，有研究強(qiáng)調(diào)精液稀釋液中的抗生素對(duì)精液中細(xì)菌的抑制作用有限[38]，為了避免這些問題，在采集過程和冷凍保存過程中應(yīng)當(dāng)遵守相應(yīng)的衛(wèi)生守則。

2.4.3 精液內(nèi)某些離子對(duì)精子質(zhì)量的影響 精漿內(nèi)鈣濃度與前向運(yùn)動(dòng)精子比例呈負(fù)相關(guān)性，因?yàn)殁}能夠調(diào)節(jié)精子活性。這種調(diào)節(jié)是由鈣濃度決定的，低濃度時(shí)能提升精子活性，高濃度時(shí)抑制精子活性。鐵和硒對(duì)質(zhì)膜完整性呈正相關(guān)性[39]。冷凍保存的豬精液在有氧環(huán)境下進(jìn)行活躍的新陳代謝，為維持氧化作用和抗氧化作用的平衡，防止氧化作用帶來?yè)p傷，鐵被鐵依賴酶(過氧化氫酶)消耗，硒被用于控制谷胱甘肽過氧化酶水平而消耗。因此，這些金屬的含量將在冷凍保存過程中下降，降低抗氧化能力。

3 豬精液稀釋液的機(jī)理

目前有多種商用精液稀釋液用于保存豬精子，提高豬冷凍精液解凍后活力和受精能力，主要由冷凍保護(hù)劑、抗氧化物質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[40]、抗冷休克物質(zhì)、緩沖劑、無機(jī)鹽[31]、抗生素[41]組成。

冷凍保護(hù)劑是豬精液稀釋液的重要組成成分，可分為滲透性和非滲透性冷凍保護(hù)劑。滲透性冷凍保護(hù)劑相對(duì)分子質(zhì)量較小，容易透過細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞內(nèi)部，主要包括甘油、乙二醇、丙二醇、 甲醇等，甘油是目前應(yīng)用最廣泛的冷凍保護(hù)劑之一。甘油的加入能夠增加其他溶質(zhì)(甘油和其他鹽)的濃度并停止冰的形成，到達(dá)比沒有甘油時(shí)更低的鹽濃度，從而使未凍結(jié)的部分變大，使細(xì)胞的收縮程度變小。除此之外，甘油可以與膜脂的極性頭基團(tuán)形成氫鍵[15,42]。在正常的水合物細(xì)胞中，極性頭基團(tuán)將由水分子(氫鍵)水合，這對(duì)膜的穩(wěn)定性極為重要[15]。因此，甘油在一定程度上具有在脫水條件下取代水的能力，增加膜的穩(wěn)定性。而且甘油能夠改變保護(hù)劑的機(jī)械性能，甘油粘度增加可以防止溶質(zhì)共生結(jié)晶[43]。而且隨著粘度增大，促進(jìn)細(xì)胞玻璃化形成，改變未凍溶液通道的形狀，增加未凍溶液的塑性，減少機(jī)械損害。非滲透性冷凍保護(hù)劑的相對(duì)分子量一般較大，主要以單糖、雙糖為主，所以在冷凍保存過程中不能滲入細(xì)胞內(nèi)，主要通過增加細(xì)胞外液滲透壓，促使細(xì)胞在冷凍時(shí)脫水，減少胞內(nèi)冰晶形成，從而保護(hù)精子免受機(jī)械損傷[44]。目前，海藻糖引起了研究人員的高度關(guān)注。海藻糖是一種十分穩(wěn)定的非還原性雙糖，與蔗糖和麥芽糖等具有相似的分子結(jié)構(gòu)和生理作用，是天然雙糖中最穩(wěn)定的糖類，而且對(duì)細(xì)胞無毒害作用。海藻糖具有獨(dú)特的非特異性保護(hù)作用，可以保護(hù)細(xì)胞磷脂的雙分子層，在冷凍過程中通過細(xì)胞膜外產(chǎn)生一種玻璃狀的保護(hù)層，提高細(xì)胞對(duì)胞外高滲溶液的耐受性，從而保護(hù)精子活性[45]。

4 其他相關(guān)研究

4.1 冷凍保存前的保溫時(shí)間

冷凍保存公司基本上遠(yuǎn)離豬場(chǎng)。為了進(jìn)行運(yùn)輸，一般將精子在精液稀釋液中稀釋(例如BTS)并在15～17 ℃保存。這一時(shí)期就叫做保溫時(shí)間，除了能使豬精液的冷凍保存更加便利外還能提高精子的抗凍性。但理想的保溫時(shí)間并不確定，Torres等[46]通過分析不同冷凍保存前的保溫時(shí)間(0, 4, 8, 12, 24, 28 和 32 h)對(duì)解凍后精子質(zhì)量的影響，從精子動(dòng)力學(xué)、質(zhì)膜和頂體膜的完整性、線粒體膜電位、超氧化陰離子檢測(cè)以及質(zhì)膜流動(dòng)性和過氧化作用等方面進(jìn)行分析，得出在冷凍保存前使用24 h的保溫時(shí)間能夠增加運(yùn)動(dòng)精子、前向運(yùn)動(dòng)精子、快速精子的比例，增加質(zhì)膜、頂體膜的完整性。至于線粒體膜電位，32 h是效果最好的保溫時(shí)間。但是過氧化陰離子等級(jí)和脂質(zhì)過氧化程度會(huì)隨時(shí)間的增加而增加，和線粒體膜電位增加相比，過氧化陰離子等級(jí)和脂質(zhì)過氧化程度增加弊大于利。而保溫時(shí)間對(duì)質(zhì)膜流動(dòng)性影響不大。因此，為了得到最好精子品質(zhì)，理想的保溫時(shí)間是24 h。

4.2 煙酸對(duì)質(zhì)膜功能及不飽和脂肪酸組成的影響

煙酸(nicotinic acid，NA)是維生素B3的衍生物，屬于維生素B家族，它不但有助于產(chǎn)生能量，還用于脂肪酸和類固醇的合成。而且NA的抗氧化能力、細(xì)胞膜保護(hù)能力以及其他作用都已經(jīng)被大量報(bào)道。在以往的研究中，NA不但提高了精子存活率和頂體完整性，而且提高了線粒體活性，抑制了頂體反應(yīng)，提高了解凍后精子的質(zhì)量。此外，NA具有穩(wěn)定的自由基、活性氧和細(xì)胞膜保護(hù)能力，但對(duì)豬精子冷凍過程中質(zhì)膜功能和多不飽和脂肪酸組成的影響尚不清楚。因此，Lee等[47]研究了不同濃度NA對(duì)解凍后精子質(zhì)膜結(jié)構(gòu)和滲透平衡、脂質(zhì)過氧化以及飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸組分比值相關(guān)的生理特性的影響。結(jié)果顯示，10 mmol/L NA處理的解凍后精子質(zhì)膜完整性明顯高于0 mmol/L和20 mmol/L NA處理組,且脂質(zhì)過氧化程度明顯下降，飽和脂肪酸顯著降低，多不飽和脂肪酸顯著增加?？傊?，10 mmol/L的NA改善了質(zhì)膜的完整性，抑制了脂質(zhì)過氧化，并增加了解凍后精子的多不飽和脂肪酸含量。這些結(jié)果表明，在豬精子冷凍保存中，NA對(duì)保護(hù)質(zhì)膜和抑制多不飽和脂肪酸的損耗可能是有用的。

4.3 精漿分離對(duì)冷凍保存后精子特性的影響

目前包括冷凍豬精液不同組分的多種方法正被用于改善冷凍保存豬精子質(zhì)量。豬精液是一種復(fù)雜的混合物，包含大量與各種受精有關(guān)的蛋白質(zhì)成分。雖然大多數(shù)豬精漿蛋白在精子功能中的作用尚未完全了解，但有證據(jù)表明精液組分對(duì)解凍后精子質(zhì)量有影響。為了探究精漿分離對(duì)豬冷凍后精子質(zhì)量的影響。Wasilewska-Sakowska等[48]通過凝膠過濾色譜法得到兩個(gè)精漿組分：精漿1(>40 kDa)和精漿2(<40 kDa)。解凍前用分離的精漿(精漿1和精漿2)、全精漿和BTS解凍液處理精液。結(jié)果顯示，全精漿處理的精子質(zhì)量明顯低于分離精漿處理和BTS處理的精子質(zhì)量；分離精漿處理的精子解凍后頂體完整性和活力明顯高于BTS處理的精子。但是經(jīng)精漿1和精漿2處理的精液樣品解凍后精子質(zhì)量并沒有差異。然而，不同試驗(yàn)組精子蛋白的電泳圖譜卻存在顯著差異，說明豬精液不同組分的低溫保護(hù)作用不同，分離后的精漿對(duì)解凍后精子質(zhì)量有不同影響。此外，作者發(fā)現(xiàn)色譜分離法可用于解決分離精漿過程中高豐度精漿組分使低豐度精漿組分無法被識(shí)別的問題。

4 總結(jié)及展望

豬精液的冷凍保存技術(shù)是推動(dòng)聯(lián)合育種、加速中國(guó)生豬產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型的重要步驟，也對(duì)保存優(yōu)質(zhì)遺傳資源、提高種公豬利用率、防止疾病傳播等有著重要意義。然而，解凍后精子活力、受胎率和窩產(chǎn)仔數(shù)方面與鮮精相比仍存在較大差距。此外，公豬廉價(jià)的經(jīng)濟(jì)價(jià)值無法匹配昂貴的儀器設(shè)備和復(fù)雜的冷凍程度等問題，導(dǎo)致豬精液的冷凍保存技術(shù)無法在實(shí)際生產(chǎn)中推廣。豬精液冷凍保存技術(shù)的關(guān)鍵在于減少精子在冷凍過程中的損傷，提高解凍后精子的活性和生殖能力，對(duì)冷凍程序進(jìn)行優(yōu)化。盡管近年來精液冷凍保存技術(shù)在精液稀釋液、解凍劑、冷凍程序等方面進(jìn)行了深入探索并取得了一定進(jìn)展，但精液冷凍保存機(jī)理尚未完全清楚。因此，就目前冷凍保存技術(shù)存在的問題來看，未來的研究可分為以下幾個(gè)方面：一是建立一套更加完善的豬精液冷凍保存體系并研發(fā)更適用于實(shí)際生產(chǎn)的精液冷凍保存設(shè)備；二是結(jié)合其他學(xué)科，累積研究經(jīng)驗(yàn)，從多角度研究豬精液冷凍保存技術(shù)；三是深入研究豬精液冷凍保存機(jī)理，力求從新的方面研究豬精液冷凍保存技術(shù)。