劉 寧， 楊柳怡， 齊雅墨， 龍 肇

(1.陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021； 2.中南林業(yè)科技大學 食品科學與工程學院， 湖南 長沙 410004)

0 引言

大米在我國不僅是一種主食，也是用于制備糖漿、發(fā)酵產業(yè)的原料，其下腳料米渣中含有40%～70%的蛋白質.米渣蛋白的保健功能近年來受到廣泛關注，具有預防糖尿病、降低膽固醇含量的保健作用，以及抗癌等功效[1].但米渣蛋白的乳化性、溶解性等功能特性較差，限制了其在食品工業(yè)的應用.因此，通過改性手段提高米渣蛋白的功能特性，具有十分重要的應用價值.

酶解是利用蛋白酶將蛋白轉化成較小分子從而使功能性質發(fā)生定向改變的方式.由于其作用溫和，酶解后的營養(yǎng)物質易被消化吸收而被廣泛關注.史洲銘等[2]利用木瓜蛋白酶酶解南極磷蝦蛋白，發(fā)現(xiàn)酶解顯著改善了南極磷蝦蛋白的吸油性、乳化性、起泡性等，提高了南極磷蝦蛋白的應用范圍.Thaiphanit等[3]和Li等[4]采用堿性蛋白酶對椰子蛋白、玉米蛋白進行限制性酶解，所得酶解物具有較好的乳化性和溶解性.

超高壓(High hydrostatic pressure，HHP)是一種非熱處理技術，如今在食品，醫(yī)藥等領域發(fā)展迅速，具有廣闊的應用前景[5,6]，相對于熱處理來說更為柔和，其壓力一般為100～1 000 MPa[7]，可將樣品密封袋置于高壓腔中，選擇水或其他流體作為傳壓介質.超高壓一般不會對蛋白質的一級結構產生影響，但會改變其非共價鍵和較弱的化學鍵以及分子間作用力[8].一般來說，超高壓處理可使食品內部的部分結構、性質以及生物活性發(fā)生一定程度的改變.由于其較強的可操作性、可控制性，及其環(huán)保綠色的處理方式，成為一項極具潛力的加工處理手段[9,10].

本文在限制性酶解的基礎上聯(lián)合超高壓改性法，研究不同處理手段對米渣蛋白乳化性的影響，以期為米渣資源的開發(fā)利用提供一定的理論依據.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米渣蛋白(蛋白含量為85.2%)，無錫金農生物科技有限公司；AP-200A堿性蛋白酶，安琪酵母股份有限公司；大豆油，中糧集團食品有限公司；磷酸氫二鈉，天津天力化學試劑有限公司；磷酸二氫鈉，天津天力化學試劑有限公司；Tris，北京博奧拓達公司；十二烷基磺酸鈉，生工生物工程(上海)有限公司；尿素，北京天力公司；ANS熒光探針，梯希愛化成工業(yè)公司.

1.2 儀器與設備

L-600/3型食品高壓處理設備，天津市華泰森淼超高壓設備有限公司；101-2型電鼓風干燥箱，北京科偉永興儀器有限公司；BP211D型電子天平，德國Sartorius公司；微量移液器，德國Eppendorf公司；TDL-40B型臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；UV2900紫外可見光分光光度儀，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；T10 Basic高速剪切分散乳化機，德國IKA有限公司；ATS-Basic I高壓均質機，加拿大奧維斯汀有限公司；MS2000激光粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司；ZS40納米粒度表面電位分析儀，英國馬爾文儀器有限公司；DM500高級臺式顯微鏡，德國萊卡微系統(tǒng)有限公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 米渣蛋白分散液的制備

稱取一定質量的米渣蛋白溶于10 mmol/L pH 8.0的磷酸緩沖液中，室溫下攪拌3 h，水化過夜，得到蛋白含量為1.0%(w/v)的蛋白分散液.

1.3.2 樣品處理

A未處理.

B僅超高壓[11]：用真空封口機將配制好的蛋白分散液密封于耐高溫高壓的10 × 20 cm聚乙烯袋中(排除氣泡).置于壓力腔內，浸沒到傳壓介質水中，設置壓力、時間和溫度參數(shù)后進行超高壓處理.處理后樣品放置于4 ℃保存，所有性質于24 h后進行測定，即只考慮不可逆的變化.超高壓處理參數(shù)為：壓力腔夾套溫度設置25 ℃，壓力范圍200 MPa，處理時間10 min.

C僅酶解：將米渣蛋白配置成2.0%(w/v)的分散液，加入堿性蛋白酶(酶活為6 000 U/g)，在pH為9.0環(huán)境下，于50 ℃水浴磁力攪拌器中酶解10 min.置于90 ℃水浴滅酶15 min，經8 000 r/min離心10 min，取上清液凍干備用.

D超高壓后酶解：先以B方法處理后，再經C步驟處理(不經凍干)，取滅酶后的酶解上清液進行下一步實驗.

E酶解后超高壓：取C方法酶解后的凍干粉，制成分散液，再經B步驟超高壓處理.

1.3.3 乳化性的測定

對經1.3.2制備的5種樣品進行乳化性的測定，采取Pearce等[12]的方法，稍有改動.取1%(w/v)的蛋白分散液15 mL與0.15 g大豆油混合，放入離心管中，設定高速剪切分散乳化機的轉速為10 000 rpm，處理1 min.之后立即用50μL微量進樣器吸取離心管底部的液體，與5 mL 0.1%(w/v)SDS溶液用渦旋振蕩器混勻后測定在500 nm波長處的吸光值.按照公式(1)計算乳化性(EAI)：

(1)

式(1)中：C-樣品濃度(g/mL)；φ-乳化液中油相的比例0.1；A-乳化液最初的吸光值；Dilution-稀釋倍數(shù).

1.3.4 表面疏水性的測定

利用ANS熒光探針法測定樣品疏水性，參考Kato等[13]的方法.

1.3.5 游離巰基含量測定

游離巰基(SH)含量的測定參考劉堅[11]的方法.

1.3.6 乳液平均粒徑的測定

參考Sandra等[14]的方法，以不同處理方式后的米渣蛋白制備水包油型乳液.乳液的平均粒徑采用馬爾文激光粒度儀分析測定，以去離子水作為分散劑，設置參數(shù)如下：通用模式，顆粒折射率1.520，分散劑折射率1.330，泵的轉速2 500 r/min.

1.3.7 乳液Zata-電位的測定

Zata-電位的測定參考孔靜[15]的方法，利用馬爾文納米粒度表面電位測定儀進行測定.測定前先用10 mmol/L pH 7.0的磷酸緩沖液稀釋樣品100倍.測定溫度為25 ℃，平衡時間1 min.

1.3.8 酶解-超高壓處理工藝的正交試驗優(yōu)化

以乳化性為考察指標，利用SPSS軟件進行正交優(yōu)化試驗，選取堿性蛋白酶酶解時間、超高壓處理壓力、超高壓處理時間，設置3因素3水平，如表1所示.

表1 正交試驗因素水平表

1.3.9 數(shù)據分析

每組數(shù)據重復測定3次取平均值，通過SPSS 16軟件計算數(shù)據差異顯著性分析(p<0.05)，通過Origin 8.5軟件作圖分析.

2 結果與討論

2.1 不同處理方法對米渣蛋白乳化性的影響

實驗研究了經5種方法處理后的米渣蛋白乳化性，結果如圖1所示.由圖可以看出，樣品B經超高壓處理，比未處理的樣品A乳化性有所提高.而經過限制性酶解的樣品C、E的乳化性也明顯提高，分別達到20.80 m2/g和23.53 m2/g，樣品E的乳化性最大.這與張晶[16]的研究結果相近，可能是由于經過超高壓或者酶解處理后能使蛋白質結構變得疏松，疏水基團和一些亞基暴露，分子量變小，使得更容易分散到油水界面，從而提高了乳化性.

圖1 不同方法處理對蛋白乳化性的影響

2.2 表面疏水性的測定

由圖2可知，與未處理的樣品A相比，其他四組的疏水性均有不同程度的提高.經過超高壓處理后，樣品B的疏水性提高，這是由于在超高壓條件下蛋白質結構變得舒展，在展開的過程中使得疏水基團進一步暴露[17].而蛋白經限制性酶解后，肽鏈的氨基酸序列變得更短，疏水基團更易暴露于蛋白質表面.

圖2 不同處理方式對表面疏水性的影響

2.3 游離巰基含量的分析

經過不同方式處理樣品的游離巰基含量如圖3所示.由圖3可以發(fā)現(xiàn)，樣品A的巰基含量為6.25μmol/g，經過超高壓的樣品B游離巰基含量下降，蛋白組分發(fā)生解離，其中一部分新產生的游離巰基會發(fā)生重組，重組的巰基基團可能發(fā)生二硫鍵交換反應或被氧化，從而使游離巰基含量減少[18].而經過酶解處理的樣品中的游離巰基含量都有不同程度的上升，樣品E的上升幅度最高.一般來說，蛋白的游離巰基含量與乳化性呈正相關[18]，因此，樣品E的乳化性最高.

圖3 不同處理方式對游離巰基含量的影響

2.4 乳液的平均粒徑測定

實驗測定了不同方法處理米渣蛋白所制備水包油型乳液的平均粒徑大小，如表2所示.從測定結果可知，樣品A的粒徑與其他樣品差距較大.經超高壓或酶解單一處理后，樣品的粒徑降低.僅超高壓的樣品B的D43從13.78μm下降到1.71μm，這可能是由于超高壓的處理使得大分子蛋白被破碎成較小的聚合體，導致其結構松散，從而使粒徑減小[19].僅酶解的樣品C的D43下降到0.57μm.樣品E的D43最小，為0.35μm，這是由于酶解和超高壓聯(lián)合處理使米渣蛋白的乳化性更好，乳液呈現(xiàn)最小的平均粒徑.

表2 不同處理方式對乳液平均粒徑的影響

*注：同一列的不同字母表示差異顯著(p<0.05).

2.5 乳液的Zeta-電位分析

通常當?shù)鞍踪|所處的pH大于等電點時，蛋白質帶負電，反之則帶正電.油滴間斥力大小取決于液滴的表面的電荷量的多少，而Zeta-電位可用來表示液滴的表面電荷量.一般電位的絕對值越大，乳液的穩(wěn)定性越好[20].通過圖4可以看出，所有乳液的電位分布在-25～-32 mV之間，并且，未經處理的樣品Zeta-電位絕對值最小，穩(wěn)定性最差，而經過限制性酶解-超高壓處理樣品的穩(wěn)定性得到明顯改善，這與乳液的平均粒徑測定結果一致.

圖4 不同處理方式對乳液Zeta-電位的影響

2.6 限制性酶解-超高壓處理的正交試驗優(yōu)化

以酶解時間、超高壓處理壓力、超高壓處理時間為變量，以蛋白乳化性(EAI)為考察值，通過正交實驗對限制性酶解-超高壓處理工藝進行了優(yōu)化，結果如表3所示.

表3 正交試驗設計及結果

由表3中分析結果可以看出，因素A(酶解時間)、因素B(超高壓處理壓力)對米渣蛋白的EAI的影響顯著(p<0.05)，因素C(超高壓處理時間)對EAI的影響不顯著，各因素影響的大小順序為：A>B>C.酶解-超高壓處理的最佳工藝條件為A2B2C2，即酶解時間10 min、超高壓處理壓力400 MPa、超高壓處理時間10 min.在該條件下進行重復性驗證試驗，結果得到，米渣蛋白的EAI為23.8 m2/g.

3 結論

通過不同方式對米渣蛋白進行處理，結果發(fā)現(xiàn)限制性酶解-超高壓處理的效果最佳，經處理后米渣蛋白的乳化性顯著提高，疏水性提高，游離巰基含量

增大.經正交實驗優(yōu)化，得到最優(yōu)處理工藝為堿性蛋白酶酶解時間10 min，超高壓處理壓力400 MPa，超高壓處理時間10 min.