楊 光，張 昆，王 俊

1.淄博市第一醫(yī)院心胸外科，山東 淄博 255200；2.中國人民解放軍濟南軍區(qū)總醫(yī)院腫瘤科，山東 濟南250031

肺癌是全世界癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一［1］。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占全部肺癌的80%。盡管近年來針對肺癌的手術(shù)治療、放療和化療已取得了長足進步，但是患者5年生存率仍不足15%［2］。尋找肺癌潛在的分子生物學標志物是近年來研究的熱點。Prospero相關(guān)同源異形盒蛋白1（prospero-related homeobox 1，PROX1）是一種高度保守的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其基因位于染色體1q32.2～32.3上，對淋巴管的形成和發(fā)育起到重要作用［3］。既往研究［4-6］發(fā)現(xiàn)，PROX1在乳腺癌、甲狀腺癌和膠質(zhì)瘤組織中高表達，并且與腫瘤細胞增殖、分化、侵襲、遷移和凋亡等密切相關(guān)。Zhu等［7］發(fā)現(xiàn)，PROX1在小細胞肺癌細胞中高表達，敲低PROX1基因后癌細胞增殖能力明顯受到抑制。PROX1在NSCLC中的表達水平及意義既往少有報道。本研究用免疫組織化學法檢測了NSCLC組織中PROX1的表達，探討PROX1與臨床病理學特征和預后的關(guān)系。此外，本研究通過下調(diào)PROX1的表達觀察NSCLC細胞增殖、侵襲和遷移的變化，以期尋找潛在的NSCLC生物學標志物。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和儀器

DF-12培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶均購自上海澤葉生物科技有限公司，Tris/EDTA修復液購自北京盛科博源生物科技有限公司，SP免疫組織化學試劑盒購自上海研卉生物科技有限公司，鼠抗人PROX1單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG、β-actin單克隆抗體購自美國Sigma公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量檢測試劑盒和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠快速制備試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司，LipoFiterTM脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購自漢恒生物科技（上海）有限公司，PROX1 si-RNA由上海吉馬制藥有限公司合成并提供，細胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）和transwell小室購自北京智杰方遠科技有限公司。CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，CX41型光學顯微鏡購自日本Olympus公司，超靈敏化學發(fā)光成像儀購自美國GE公司，微孔板閱讀器購自德國耶拿分析儀器股份公司。

1.1.2 細胞

人NSCLC細胞系A(chǔ)549、H460、H1229和H358，人支氣管上皮細胞Beas-2b均購自中國科學院典藏培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫/中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素的DF-12培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%，每3 d換液1次，當細胞融合度達80%時進行傳代。

1.1.3 組織樣本

選取2011年1月—2013年6月在淄博市第一醫(yī)院進行擇期手術(shù)治療且資料完整的NSCLC患者86例，術(shù)前均未接受放化療或免疫治療，術(shù)后經(jīng)病理學檢查證實為NSCLC。86例患者中男性50例，女性36例；年齡46～68歲，平均（57.98±9.04）歲；TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期37例，Ⅰ～Ⅱ期49例；腫瘤直徑≥3 cm者55例，＜3 cm者31例；吸煙45例；腺癌48例，鱗癌38例；出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例、遠處轉(zhuǎn)移12例。術(shù)中留取癌組織及配對的癌旁組織（距離癌組織≥5 cm［8］），組織石蠟標本均由淄博市第一醫(yī)院病理科完成。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學法檢測組織中PROX1的表達

石蠟切片厚度為4 μm，在70 ℃下烤片30 min，隨后進行脫蠟處理。用Tris/EDTA修復液進行抗原修復，羊血清封閉30 min，加入鼠抗人PROX1單克隆抗體（1∶200）4 ℃過夜，加入辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG，37 ℃溫育30 min。隨后用辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液和二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色液處理，蘇木紫復染。經(jīng)過脫水、透明、封片處理后在顯微鏡下觀察。每張切片隨機取10個視野，每個視野計數(shù)100個癌細胞，根據(jù)細胞的染色強度及陽性細胞比例判斷PROX1表達情況。染色為陰性記0分、淺黃色1分、棕黃色2分、棕褐色3分；陽性細胞數(shù)為0%～10%記1分、11%～50%記2分、51%～80%記3分、81%～100%記4分，將二者評分相乘得出最終結(jié)果：0分（陰性）；1～3分（弱陽性）；4～8分（中等陽性）；9～12（強陽性）。0～3分低表達；4～12分為高表達［9］。

1.2.2 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測

取對數(shù)生長期細胞加入蛋白裂解液，冰上裂解25 min后，12 000×g離心15 min后收集上清液。用BCA法檢測蛋白濃度，每孔上樣蛋白量為50 μg。經(jīng)凝膠電泳（SDS-PAGE）后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，脫脂奶粉封閉1 h，溫育一抗（鼠抗人PROX1單克隆抗體，1∶200），4 ℃過夜后棄去一抗，洗膜緩沖液（tris-buffered saline Tween，TBST）洗膜3次。隨后室溫溫育二抗2 h，棄去二抗，TBST洗膜3次，每次5 min。以β-actin作為內(nèi)參，采用電化學發(fā)光（electrochemical luminescence，ECL）儀對蛋白成像，采用Image J軟件分析灰度值。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染

以2×105個細胞/孔將A549細胞接種于6孔板中。轉(zhuǎn)染前用PBS洗滌細胞2次，加入1.8 mL無血清培養(yǎng)基。分別用100 μL無血清培養(yǎng)基稀釋10 μL LipoFiter和10 mL si-RNA（或者si-control），靜置5 min后將二者混勻，混合物加入6孔培養(yǎng)板中，轉(zhuǎn)染6 h。si-RNA序列為5’-GGACGGGAAGUUAGACAAAGA-3’；si-control序列為5’-GGAAGUUAGACAA AGAUGAGA-3’。

1.2.4 克隆形成實驗

轉(zhuǎn)染24 h后，用2.5 g/L胰蛋白酶消化細胞，以1 000個細胞/孔將細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，置于37℃、CO2體積分數(shù)為5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)中，培養(yǎng)3周，每3 d換液1次。當出現(xiàn)菌落時停止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)基。用4%多聚甲醛固定30 min，隨后用結(jié)晶紫染色，統(tǒng)計每孔克隆數(shù)目。實驗重復4次。

1.2.5 細胞增殖實驗

轉(zhuǎn)染后將細胞以10 000個/孔接種于24孔板中，使用CCK-8試劑盒檢測細胞活性，培養(yǎng)24、48、72和96 h后，向每孔中添加10 μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。用微孔板閱讀器在490 nm波長處讀取吸光度（D）值。實驗重復4次。

1.2.6 Transwell侵襲與遷移實驗

在transwell遷移板下室每孔中加入600 μL培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后以5×104個細胞/孔的密度將細胞鋪于transwell遷移板上室中，溫室培養(yǎng)24 h。棄去上室培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次，隨后用4%多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色15 min。用棉簽拭去上室上層黏附的細胞，進行拍照和計數(shù)。對于侵襲試驗，首先在transwell遷移板上室鋪基質(zhì)膠，每孔接種1×105個細胞，侵襲48 h后進行分析，步驟同遷移實驗。實驗重復4次。

1.3 統(tǒng)計學處理

用SPSS 19.0進行統(tǒng)計學分析。兩組間計量資料比較用t檢驗，計數(shù)資料比較用χ2檢驗；多組間比較用單因素方差分析；等級資料采用非參數(shù)檢驗；重復測量資料用重復測量方差分析；生存分析用Kaplan-Meier法，多因素分析用COX比例風險回歸模型。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PROX1在NSCLC中的表達

免疫組織化學檢測結(jié)果顯示，NSCLC組織和癌旁組織中PROX1有不同程度的表達，PROX1主要分布在細胞核里，在細胞質(zhì)中也有表達（圖1）。癌組織中PROX1陰性、弱陽性、中等陽性、強陽性分別6例、25例、20例、35例；癌旁組織中分別48例、27例、8例、3例，癌組織中PROX1陽性表達率明顯高于癌旁組織（Z=-8.021，P＜0.001）。Western blot檢測結(jié)果顯示，與Beas-2b相比，A549、H460、H1229和H358細胞系中PROX1蛋白表達水平明顯較高（P均＜0.05，圖2）。

2.2 PROX1與NSCLC臨床病理學特征及預后的關(guān)系

PROX1高表達組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率和TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期的占比明顯高于低表達組（P＜0.05）。

COX多因素分析結(jié)果顯示，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和PROX1高表達是NSCLC患者不良生存預后的獨立影響因素（P＜0.05）。PROX1高表達組生存時間明顯短于低表達組（P＜0.001，圖3，表1、2）。

2.3 下調(diào)PROX1對A549細胞增殖、遷移和侵襲的影響

與si-control組比較，si-RNA組PROX1蛋白表達水平、細胞克隆數(shù)目、培養(yǎng)第72和96 h時細胞增殖的D值、侵襲和遷移細胞數(shù)量明顯較低（P＜0.01，圖4～5）。

圖1 免疫組織化學法檢測PROX1在NSCLC組織中的表達Fig.1 PROX1 expression in NSCLC tissues detected by immunohistochemistry

圖2 Western blot檢測細胞中PROX1蛋白表達水平（n=4）Fig.2 Western blot detection of PROX1 protein expression in cells (n=4)

圖3 PROX1高表達和低表達患者的生存時間比較Fig.3 Comparison of survival time between patients with high and low PROX1 expression

表1 PROX1與NSCLC臨床病理學特征的關(guān)系Tab.1 Relationship between PROX1 and clinicopathological characteristics of NSCLC［n (%)］

表2 NSCLC患者生存時間的影響因素分析Tab.2 Analysis of factors influencing the survival time of NSCLC patients

圖4 敲降PROX1對A549細胞PROX1蛋白表達水平的影響（n=4）Fig.4 The effect of knockdown PROX1 on the expression level of PROX1 protein in A549 cells (n=4)

圖5 敲降PROX1對A549細胞增殖、遷移和侵襲的影響（n=4）Fig.5 Effect of knockdown PROX1 on proliferation,migration and invasion of A549 cells (n=4)

3 討 論

肺癌是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病機制復雜，目前尚未完全明確。本研究發(fā)現(xiàn)，癌組織中PROX1陽性表達率明顯高于癌旁組織，并且PROX1與腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移有關(guān)，可能成為NSCLC潛在的分子生物學標志物。

PROX1在1996年首次被分離，是果蠅的同源異形盒基因prospero在哺乳動物中的同源框基因轉(zhuǎn)錄因子。PROX1在乳腺癌、甲狀腺癌和膠質(zhì)瘤組織中高表達，并且與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切［4-6］。本研究采用免疫組織化學法檢測了86例NSCLC組織中PROX1的表達，結(jié)果顯示，癌組織中PROX1高表達55例（63.95%），癌旁組織高表達11例（12.79%），組間比較差異有統(tǒng)計學意義。另外，與人支氣管上皮細胞Beas-2b相比，A549、H460、H1229和H358細胞系中PROX1蛋白表達水平明顯較高。本研究還發(fā)現(xiàn)，敲低PROX1基因后，A549細胞增殖、遷移和侵襲明顯受到抑制。說明PROX1可能作為癌基因參與NSCLC的發(fā)生。

PROX1在癌癥中的作用機制尚未明了，可能為：①結(jié)合并抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-14表達，進而參與腫瘤血管生成和腫瘤侵襲［10］；②通過核小體重塑和去乙酰化酶復合物抑制Notch信號通路，進而抑制腫瘤細胞的增殖［11］；③參與免疫炎癥損傷，通過激活核因子κB促進瘤細胞增殖和侵襲；④表達于淋巴管內(nèi)皮細胞，參與腫瘤淋巴管新生和腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移［3］。

本研究結(jié)果顯示，PROX1表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期密切相關(guān)。在多種類型腫瘤中，淋巴管是腫瘤轉(zhuǎn)移的主要途徑。PROX1主要分布在淋巴管內(nèi)皮細胞核里，在腫瘤組織內(nèi)皮細胞中表達上調(diào)［12］。既往研究［13-14］發(fā)現(xiàn)，PROX1有促進內(nèi)皮細胞分化和淋巴管形成的作用，可能會作為預測腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因子。本研究86例患者中發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移12例，其中PROX1高表達10例，占83.33%；未發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的74例患者中PROX1高表達45例，占60.81%，但兩組比較差異無統(tǒng)計學意義，可能與樣本量小有關(guān)。

TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移是NSCLC患者不良生存預后的影響因素，既往已被證實［15-17］。PROX1高表達與多種腫瘤的不良生存預后有關(guān)，如乳腺癌［18］、胃癌［19］和唾液腺樣囊性癌［20］等。本研究COX多因素分析結(jié)果顯示，PROX1是NSCLC患者不良生存預后的獨立影響因素，PROX1高表達組生存時間明顯短于低表達組。

綜上所述，PROX1在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中可能起到重要作用，敲降PROX1基因可以抑制NSCLC細胞的增殖、侵襲和遷移。PROX1與NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤TNM分期有關(guān)，PROX1高表達可能預示患者不良生存預后。本研究也存在一些局限性，例如未分析PROX1下游分子的變化，臨床樣本量較小。未來需要深入探討PROX1在NSCLC中的作用機制。