劉鎳 蘇文淵 覃輝 何博 胥勇 劉信 羅曉舟 唐純志 羅倫

(成都市第二人民醫(yī)院 1康復(fù)醫(yī)學(xué)科，四川 成都 610000;2骨外科;3廣州中醫(yī)藥大學(xué))

越來越多的證據(jù)顯示，交感神經(jīng)活動增加在高血壓的早期具有明顯相關(guān)性。神經(jīng)-心血管調(diào)控機(jī)制的異常是神經(jīng)源性高血壓的主要特征。心血管舒縮、心臟交感神經(jīng)興奮性增強(qiáng)及副交感神經(jīng)的降低是神經(jīng)-心血管調(diào)控機(jī)制異常的主要原因〔1～3〕。在自發(fā)性高血壓大鼠的研究中提示，幼鼠的腦干和下丘腦中申訴水平的升高對其成年后動脈壓和壓力感受器的反射具有激活效應(yīng)〔4～7〕。交感神經(jīng)的興奮不僅可以引發(fā)高血壓，還可以將其維持在一個較高的水平。從Pubmed檢索以神經(jīng)源性高血壓為題目的研究可以看出，從2008年的33項(xiàng)到2017年的61項(xiàng)，關(guān)于本病的文章逐年升高，本病已成為學(xué)界研究熱點(diǎn)之一。本研究旨在研究神經(jīng)源性高血壓小鼠下丘腦的基因組學(xué)差異靶基因，以期為臨床開發(fā)本病治療藥物拓展新的思路。

1 資料與方法

1.1資料來源 利用NCBI中GEO數(shù)據(jù)庫查詢下載GSE25076〔8〕基因芯片數(shù)據(jù)。

1.2方法 在NCBI提供的GEO2R平臺內(nèi)檢索GSE25076，將全部數(shù)據(jù)下載保存為Excel格式，并進(jìn)行差異基因分析。采用DAVID平臺進(jìn)行基因本體論(GO)分析，京都基因與基因組百科全書(KEGG)平臺進(jìn)行KEGG通路分析，STRING平臺進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)分析。除基因互作網(wǎng)絡(luò)圖外，其余圖片均由R信號2.1.5制作。

2 結(jié) 果

2.1差異基因選取條件及結(jié)果 在GEO2R平臺內(nèi)對BPH/2J小鼠下丘腦基因芯片數(shù)據(jù)(n=6)和正常血壓BPN/2J小鼠下丘腦基因芯片數(shù)據(jù)(n=6)進(jìn)行分析，共獲得34 760個差異基因，火山圖如圖1所示。以|logFC|>1.5、P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)對所有基因進(jìn)行篩選，最終獲得28個符合上述條件的基因。如表1所示。使用R信號V 3.5.1 plot程序包生成層次聚類熱圖，如圖2所示。聚類結(jié)果很好地將兩組小鼠加以區(qū)分。

2.2基因本體分析(GOEA) GOEA被用于在基因或基因產(chǎn)物列表中篩選基因本體的過度表達(dá)，以便了解它們的生物學(xué)意義。來自世界各地的基因本體聯(lián)盟(GOC)〔7〕。成員合作開發(fā)GO，它是一種用于描述跨多個物種的基因產(chǎn)物的生物學(xué)過程，細(xì)胞組分和分子功能的資源。在DAVID平臺錄入上述60個基因后篩選P<0.05的GO條目，如表2所示。結(jié)果在生物學(xué)過程方面得到的28個差異基因富集在磷脂分解代謝過程〔甘油磷酸二酯磷酸二酯酶結(jié)構(gòu)域(GDPD)3,IVE組磷脂酶A2(PLA2G4E)〕。分子功能方面多表現(xiàn)為水解酶活性〔真核翻譯起始因子(EIF)4A3,自噬相關(guān)半胱氨酸肽酶(ATG)4A,鹵代酸脫鹵酶樣化解酶結(jié)構(gòu)域(HDHD)3,核糖核酸酶(POP4),GDPD3,PLA2G4E〕。

2.3KEGG通路富集分析 將上述60個基因進(jìn)行KEGG分析，以Bonferroni法對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)僅RNA轉(zhuǎn)運(yùn)通路具有統(tǒng)計學(xué)顯著性。相關(guān)基因有EIF4A3、POP4兩個。

2.4差異基因的相互作用分析 將上述28個差異基因錄入STRING數(shù)據(jù)庫，在去除渙散鏈接基因后，總共篩選出25個基因。這25個基因是已被證實(shí)或STRING預(yù)測其具有相互作用的基因?；プ骶W(wǎng)絡(luò)圖如圖3所示。通過觀察可知，處于節(jié)點(diǎn)位置且鏈接數(shù)目最多的基因是Rps9、Rps16、Fau、Rps11、Rbm8a、Eif4a3、Pop4、Slc25a31等。

圖1 火山圖

表1 差異基因列表

續(xù)表1 差異基因列表

圖2 差異基因熱圖

表2 GO分析結(jié)果

圖3 差異基因互相作用網(wǎng)絡(luò)

3 討 論

GSE25076數(shù)據(jù)是采用Affymetrix Mouse Gene 1.0 ST Array平臺，鑒定26周齡BPH/2J高血壓小鼠和正常BPN/2J小鼠下丘腦中的基因表達(dá)譜。

下載數(shù)據(jù)集后，通過設(shè)定篩選條件，我們最終得到28個差異基因。其中12個在神經(jīng)源性高血壓小鼠中表達(dá)下調(diào)，16個表達(dá)上調(diào)。通過聚類分析，這28個差異基因很好地將兩組小鼠聚為兩類。GO分析和KEGG通路富集分析結(jié)果表明：在GO分析方面，鑒定出的差異基因在磷脂分解代謝過程、水解酶活性調(diào)節(jié)等過程發(fā)揮著重要作用。KEGG通路富集結(jié)果表明RNA轉(zhuǎn)運(yùn)通路可能是本病發(fā)病機(jī)制中有著關(guān)節(jié)作用的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。基因互作(PPI)分析結(jié)果表明，28個差異基因中有13個具有互相作用。

取GO富集條目、KEGG通路富集結(jié)果和蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)PPI相連節(jié)點(diǎn)的交集，得到EIF4A3,POP4兩個基因?？赏茰y這兩個基因可能在BPH/2J小鼠高血壓發(fā)病機(jī)制中有著重要地位。

真核翻譯起始因子(EIF)4A3已被證明其表達(dá)下調(diào)將會導(dǎo)致胚胎發(fā)育過程中神經(jīng)脊細(xì)胞遷移/分化和神經(jīng)干細(xì)胞凋亡，與Richieri-Costa-Pereira綜合征顱骨缺損和小頭畸形有著密切關(guān)聯(lián)〔9,10〕。雖然目前其具體機(jī)制尚不明晰，但不可否認(rèn)的是其在神經(jīng)發(fā)育過程中有著重要作用。EIF4A3編碼DEAD-box解旋酶，它是RNA結(jié)合外顯子連接復(fù)合物(EJC)的核心組成部分，它控制轉(zhuǎn)錄后事件，包括選擇性剪接，非有義介導(dǎo)的mRNA衰變，翻譯起始和RNA定位〔11〕。除了胚胎神經(jīng)發(fā)育之外，越來越多的證據(jù)表明其在神經(jīng)元細(xì)胞軸突生長、突觸形成中也有著重要地位。EIF4A3與海馬神經(jīng)元樹突中信使核糖核蛋白(mRNP)復(fù)合物中的UPF1有關(guān)〔12〕。Eif4a3或Upf1的缺失導(dǎo)致Arc的積累并增加微型興奮性突觸后電流(mEPSC)的幅度，這與Arc在AMPA受體運(yùn)輸中確定的作用一致〔13〕。另一項(xiàng)研究表明Eif4a3在大鼠新環(huán)境探索的背景下進(jìn)行弧調(diào)節(jié)，該研究認(rèn)為Eif4a3與空間學(xué)習(xí)相關(guān)〔14〕。

核糖核酸酶(POP)4，是脊椎動物特異性的分泌性核糖核酸酶〔15〕。核糖核酸酶4是不同脊椎動物物種中最保守的基因〔16〕。不同脊椎動物物種的氨基酸同源性高達(dá)94%〔16〕。POP4具有非常嚴(yán)格的底物特異性-強(qiáng)烈傾向于在切割位點(diǎn)的3′側(cè)使用尿苷〔17〕。POP4蛋白不僅具有血管生成，還具有神經(jīng)源性和神經(jīng)保護(hù)作用，在體外，離體和體內(nèi)測定中誘導(dǎo)血管生成。誘導(dǎo)小鼠胚胎干(ES)和胚胎癌細(xì)胞的神經(jīng)球形成和神經(jīng)元分化，刺激小鼠胚胎皮質(zhì)神經(jīng)元的神經(jīng)絲形成并防止應(yīng)激誘導(dǎo)的變性。血管生成和神經(jīng)發(fā)生在解剖學(xué)和形態(tài)學(xué)上密切相關(guān)〔18〕。神經(jīng)和血管系統(tǒng)是平行發(fā)展的，它們之間存在高度的串?dāng)_。血管和神經(jīng)被引導(dǎo)到他們的目標(biāo)，并且經(jīng)常并排追蹤〔19〕。血管和神經(jīng)共享許多共同的原則和信號，用于形成模式和生存。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)生的分子和信號也調(diào)節(jié)血管生成。例如，semaphorin-plexin系統(tǒng)在血管生成和神經(jīng)發(fā)生中具有重要作用〔20〕。

綜上所述，EIF4A3和POP4最為可能是神經(jīng)源性高血壓發(fā)生的基因?qū)用娴脑?，通過RNA轉(zhuǎn)運(yùn)通路，影響神經(jīng)發(fā)育、血管生成及神經(jīng)發(fā)生等過程，最終導(dǎo)致本病的發(fā)生發(fā)展。但需要說明的是，關(guān)于這兩種基因在分子層面的具體作用機(jī)制，上下游調(diào)節(jié)信號尚且還不明晰，有待進(jìn)一步研究。