韓宇鵬 孟慶云 楊舒賀 楊松

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

各種慢性腎臟疾病(CKD)中腎臟纖維化(RIF)是進展為終末期腎衰竭(ESRD)的一種病理損傷過程，其特征病理變化主要包括腎小管間質炎癥和纖維化、腎小管萎縮和擴張及腎小球硬化等〔1～4〕。研究顯示，影響CKD預后中腎小管間質損傷嚴重程度是決定因素〔5～7〕。分析RIF的相關發(fā)病機制及研發(fā)抗腎間質纖維化的藥物，對于控制CKD具有重要意義。本文研究旨在探討尿毒清顆粒對單側輸尿管梗阻(UUO)大鼠腎間質纖維化及腎功能和轉化生長因子(TGF)-β1表達的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料 清潔級雄性Wistar大鼠90只，體質量(150±10)g，適應性飼養(yǎng)1 w，實驗動物每天予以12 h光照，飼養(yǎng)溫度(22±2)℃，相對濕度(55±2)%。動物飼料、墊料、飲用水均已消毒，大鼠來源于佳木斯大學實驗動物中心。

1.2實驗分組及UUO模型制備 按照隨機數(shù)字法分為假手術組、模型組、實驗組各30只。模型組和實驗組行左側輸尿管結扎術，均于無菌條件下進行，給予(0.3～0.4)ml/100 g的10%水合氯醛進行腹腔內注射麻醉，于大鼠背部，左側肋腰點下0.5 cm左右及脊柱左側1 cm左右做一1.5～2.0 cm的縱向切口，逐層進腹，大鼠腎臟充分暴露。將腎下及部分包膜和腎蒂處包膜用小彎鑷輕輕剝離，將大鼠輸尿管分離出，分別在遠離腎盂1 cm左右處及緊靠腎盂處應用“0”號絲線結扎輸尿管，并且于兩結中間將輸尿管剪斷，對大鼠腹腔用慶大霉素生理鹽水沖洗，檢查若無出血和滲漏后將腹膜腔各層及背部皮膚逐層縫合，常規(guī)消毒，覆蓋無菌鋪巾。其中假手術組手術除不剪斷及不結扎輸尿管外，其余操作同模型組和實驗組。

1.3給藥方法 實驗組給予尿毒清顆粒每日2 g/kg灌胃，假手術組與模型組灌胃等劑量生理鹽水，每日1次，連續(xù)14 d。各組于手術后第14天處死，留取左側梗阻腎標本。

1.4腎組織病理光鏡檢測 取大鼠左腎組織，應用甲醛固定后石蠟包埋切片，將其切成3 μm切片后行蘇木素-伊紅(HE)。HE染色觀察腎小管間質細胞浸潤及病理改變，半定量分析腎臟間質纖維化。

1.5腎功能指標測定 采集大鼠下腔靜脈血，經(jīng)1 500 r/min離心5 min后取血清，采用全自動生化分析儀，檢測血尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)水平。

1.6血清TGF-β1表達 取1.5血清標本，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定血清TGF-β1水平。

1.7腎組織中TGF-β1表達 所有腎組織標本按常規(guī)固定、脫水、透明、石蠟包埋，切片4 μm。將切片脫蠟，熱抗原修復，分別滴加一抗兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體(1∶120)。4℃孵育過夜,滴加二抗，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染細胞核，每次染色均以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對照，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。采用免疫組織化學法測定TGF-β1表達，以胞質出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，測定TGF-β1陽性面積。

1.8統(tǒng)計學方法 運用SPSS22.0軟件統(tǒng)計進行t、F檢驗。

2 結 果

2.1各組組織病理表現(xiàn)比較 假手術組腎組織形態(tài)結構基本正常；模型組第14天時發(fā)生間質增寬、間質炎細胞浸潤、腎小管萎縮及RIF表現(xiàn)；實驗組RIF程度明顯減輕。見圖1。

2.2各組腎功能變化比較 模型組和實驗組BUN和Scr表達、血清及腎臟組織TGF-β1表達顯著高于假手術組，且實驗組顯著低于對照組(P<0.05)。見表1。

圖1 各組腎臟組織纖維化表現(xiàn)(HE，×200)

表1 各組腎功能變化、血清及腎臟組織TGF-β1表達比較

3 討 論

目前已知的腎間質纖維化機制包括：腎小管上皮細胞轉分化、腎間質成纖維細胞活化與增殖、細胞外基質轉換失平衡、腎組織局部缺氧缺血〔7，8〕。腎小管上皮細胞轉分化在腎小管間質纖維化中扮演重要角色。在腎損傷過程中，多種因子誘導上皮細胞部分轉化為成纖維細胞，若及時干預則能恢復上皮細胞的完整性，阻斷腎小管上皮細胞轉分化的發(fā)生〔9～11〕。目前，對腎小管上皮細胞轉分化在腎間質纖維化發(fā)生發(fā)展中的重要性仍缺乏全面認識。

尿毒清顆粒作為一種中成藥，組成主要包括黃芪、黨參、制何首烏、制大黃、白術、車前草、茯苓、丹參、川芎、姜半夏等，其中黃芪和黨參具有益氣健脾功效，制何首烏具有益精補腎功效，共奏益腎健脾功效；制大黃具有通腑泄?jié)峁π?，可使?jié)駶嶂坝纱蟊闩懦?，白術具有除濕健脾功效，車前草和茯苓具有除濕利尿功效，姜半夏具有降逆止嘔、燥濕何種功效，共奏通腑降濁功效；丹參和川芎具有活血化瘀功效?？v觀全方可奏通腑降濁、活血化瘀和健脾利濕功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，尿毒清顆?？梢愿纳苹颊叩牡|水平，降低腎組織代謝水平，健脾利濕，活血化瘀，不良反應小，達到較好臨床效果〔12，13〕。程錦繡等〔14〕實驗證實尿毒清顆?？商岣呗阅I衰竭大鼠生存質量，降低Scr、BUN水平，其機制與調節(jié)TGF-β1通路有關。此外，劉新輝等〔15〕實驗證實黃芪甲苷可保護TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞間充質轉分化,其機制可能與增加線粒體生物合成有關。本研究表明，尿毒清顆粒可減輕腎間質纖維化；模型組和實驗組BUN和Scr表達高于假手術組，且實驗組低于對照組，由此可見尿毒清顆?？筛纳颇I功能。

TGF-β是腎間質纖維化過程中最重要的生長因子之一，在腎間質纖維化發(fā)生、發(fā)展的多個環(huán)節(jié)起作用〔16〕。TGF-β1是TGF-β家族中的一員，是纖維化的關鍵因子，可通過促進腎臟細胞肥大、腎臟的免疫調節(jié)和細胞外基質的生成來介導腎小球硬化〔17，18〕。TGF-β1被認為是上皮細胞-間充質轉化過程的主要誘導因子。

綜上，尿毒清顆粒可減輕UUO大鼠腎間質纖維化，改善腎功能及降低TGF-β1表達。