徐曉東 李慎 陳亞鋒 王慶濤 田衛(wèi)中

(1荊門(mén)市第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)一科，湖北 荊門(mén) 448000；2武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

心肌細(xì)胞肥大是心臟受到高血壓、瓣膜病和心肌梗死等心臟病的刺激后發(fā)生的一種代償性重構(gòu)，但持續(xù)的心肌細(xì)胞肥大可增加心血管意外事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，最終導(dǎo)致心絞痛、心力衰竭和猝死〔1～4〕。研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(miRNA)在心血管系統(tǒng)疾病及心肌細(xì)胞肥厚發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色〔5～7〕。miRNA-126是來(lái)源于內(nèi)皮細(xì)胞的miRNA，在冠心病及心力衰竭患者中呈低表達(dá)狀態(tài)〔8，9〕，且其水平與患者的年齡、紐約心臟病協(xié)會(huì)(NYHA)分級(jí)呈負(fù)相關(guān)〔10～12〕。同時(shí)，亦有研究顯示〔13〕，miRNA-126與心臟細(xì)胞骨架調(diào)控蛋白Twinfilin-1(Twf1)的3′非編碼區(qū)(UTR)存在結(jié)合位點(diǎn)。而Twf1在肌動(dòng)蛋白單體的動(dòng)態(tài)平衡及心肌細(xì)胞骨架微絲的極向生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能〔14〕。因此，我們推測(cè)上調(diào)miRNA-126的表達(dá)可能能夠抑制心肌細(xì)胞的肥大。本研究旨在觀(guān)察miRNA-126下調(diào)細(xì)胞骨架調(diào)控蛋白Twf1對(duì)心肌細(xì)胞肥大的抑制效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1材料 胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；SuperScript Ⅱ反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Gibco公司；TRIzol試劑購(gòu)自上海寶曼生物科技有限公司；抗α肌動(dòng)蛋白購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；內(nèi)皮素ET-1試劑購(gòu)自美國(guó)R&D公司；pMIRNA-REPORT熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)購(gòu)自北京億森寶生物科技有限公司；實(shí)時(shí)定量(qRT)-PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)ABI(life)公司；miRNA-126引物、miRNA-126化學(xué)修飾短鏈RNA模擬物、錯(cuò)義miRNA(scr-miRNA)對(duì)照物、HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司；Bio-Rad蛋白分析試劑盒購(gòu)于上海力敏實(shí)業(yè)有限公司；兔抗-Twf1抗體、小鼠抗-p-Twf1抗體、兔抗cTnI抗體、小鼠抗GAPDH抗體購(gòu)于上海亨代勞生物儀器有限公司；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2心肌細(xì)胞培養(yǎng) 選擇1～2天齡的Sprague Dawler(SD)大鼠飼養(yǎng)，對(duì)7 d內(nèi)新生大鼠采用七氟烷吸入麻醉，速取心臟，70%乙醇溶液浸泡，分離心室；使用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液中浸泡洗滌1 min/次，反復(fù)3次；添加1 ml胰蛋白酶消化液(濃度0.25%)消化，細(xì)胞回縮變圓后使用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止。常溫下400 r/min離心10 min處理，提取上清液。加入30 μg/L BrdU培養(yǎng)基單層培養(yǎng)24 h，密度5×104/cm2。

1.3qRT-PCR檢測(cè) 利用TRIzol試劑按照操作說(shuō)明提取總RNA，通過(guò)2 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過(guò)qRT-PCR法檢測(cè)miRNA-126。心房鈉尿肽(ANP)正義鏈為5′-AGAAACCAGAGAGTGAGCCG-3′，反義鏈為5′-GGTGGTCTAGCAGGTTCTTGAAA-3′，55℃退火，產(chǎn)物長(zhǎng)度195 bp；α-輔肌動(dòng)蛋白(actinin)正義鏈為5′-GGCTGTGTTCCCATCCATCGT-3′，反義鏈為5′-CCCGGTTAGCTTTGGGGTTCA-3′，退火溫度57℃，產(chǎn)物長(zhǎng)度266 bp；Myh6正義鏈為5′-AGAGTGACAGGATGACGGAT-3′，反義鏈為5′-TCCTTCACAGTCACCGTCTTG-3′，退火溫度57℃，產(chǎn)物長(zhǎng)度229 bp；Myh7正義鏈為5′-CAGTCATGGCGGATCGAGAG-3′，反義鏈為5′-CGGATTCTCCGGTGATGAGG-3′，退火溫度55℃，產(chǎn)物長(zhǎng)度546 bp；內(nèi)參照為GAPDH。用SYBR Green熒光qRT-PCR測(cè)定基因表達(dá)。反轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物電泳驗(yàn)證引物的有效性。BioEasySYBR Green Ⅰ試劑盒進(jìn)行定量檢測(cè)。采取2-△△Ct方法計(jì)算miRNA-126的相對(duì)表達(dá)量。

1.4心肌細(xì)胞肥大誘導(dǎo)與測(cè)定 使用60 nmol/L ET-1誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，細(xì)胞貼附蓋玻片培養(yǎng)，采取4%甲醛溶液固定后，采用PBS清洗，添加10%山羊血清靜置1 h，添加抗α-actinin染色(1∶1 000)，4℃環(huán)境下過(guò)夜孵育。PBS清洗3次，甩干，進(jìn)行fluorescein二抗標(biāo)記，并以4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色細(xì)胞核。使用圖像分析軟件測(cè)量心肌細(xì)胞表面積，每組熒光顯微鏡下觀(guān)察測(cè)定肥大心肌細(xì)胞，每組50個(gè)，重復(fù)6次，取平均值。

1.5miRNA-126過(guò)表達(dá) 以HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行miRNA-126染色，簡(jiǎn)要操作如下：5 nmol miRNA-126模擬物(syn-rno-miRNA-126)與20 μl HiPerFect混合，加入100 μl無(wú)血清培養(yǎng)基內(nèi)常溫培養(yǎng)10 min，獲得轉(zhuǎn)染復(fù)合物，孵育48 h。對(duì)照物為scr-miRNA片段。

1.6Western印跡法 取標(biāo)本，置于冰上裂解1 h，提取總蛋白備用。10 000 r/min條件下離心處理5 min，使用容量瓶轉(zhuǎn)移上清液，使用Bio-Rad蛋白分析試劑盒測(cè)定蛋白濃度。使用聚丙烯酰胺凝膠(10%分離，4%積層)電泳總蛋白，再將其轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，加封閉液稀釋后室溫?fù)u床孵育1 h。4℃冰箱過(guò)夜，添加一抗、洗脫，添加二抗(1∶2 000)孵育1 h。使用化學(xué)發(fā)光法顯影成像，獲得蛋白條帶，以GAPDH為內(nèi)參照，使用軟件進(jìn)行處理，獲得目標(biāo)條帶與參照條帶的密度的比值。

1.7熒光素酶分析 構(gòu)建標(biāo)記全序列大鼠Twf13′-UTR的嵌合熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，陰性對(duì)照為3′-UTR的41-42位點(diǎn)CT→GA突變(3′-mUTR)。進(jìn)行miRNA-126、scr-miRNA處理后，以熒光載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞系。48 h后添加底物，并檢測(cè)熒光素酶活性，熒光素活性參照值為(1 572±489)相對(duì)光單位(RLU)，最終數(shù)值表示為與熒光素酶活性參照值的比值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1肥大心肌細(xì)胞中miRNA-126表達(dá)及外源性miRNA-126對(duì)肥大心肌細(xì)胞表面積的影響 qRT-PCR檢測(cè)顯示，ET-1誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞的miRNA-126表達(dá)量顯著低于正常心肌細(xì)胞〔(0.73±0.06)vs (1.00±0.12)，n=3，t=3.486，P=0.025〕。

免疫熒光染色法測(cè)定ET-1誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞(對(duì)照組)的表面積為(4 720±973)μm2，經(jīng)外源性miRNA-126干預(yù)后，心肌細(xì)胞縮小為(2 364±650)μm2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=6，t=4.932，P=0.001);而scr-miRNA-126對(duì)照干預(yù)后心肌細(xì)胞的表面積為(4 598±967)μm2，與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=6，t=0.218，P=0.832)，見(jiàn)圖1。

圖1 免疫熒光染色法測(cè)定外源性miRNA-126對(duì)ET-1誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞的表面積的影響

2.2miRNA-126對(duì)心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志性基因表達(dá)的影響 miRNA-126模擬物轉(zhuǎn)染組心肌細(xì)胞中經(jīng)典的肥大標(biāo)志性基因ANP、α-actin、Myh6、Myh7相對(duì)表達(dá)水平分別為(0.40±0.05、0.39±0.04、0.47±0.08、0.29±0.03)均顯著低于空白對(duì)照組(0.70±0.09、0.82±0.11、0.93±0.13、0.72±0.10,n=3，t=5.047，P=0.007；t=6.363，P=0.003；t=5.220，P=0.006；t=7.134，P=0.002)。見(jiàn)圖2。

1:空白對(duì)照組；2：miRNA-126模擬物轉(zhuǎn)染組圖2 各心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志性基因表達(dá)情況

2.3miRNA-126靶基因的預(yù)測(cè)和驗(yàn)證 miRNA-126與Twf1的3′-UTR核心區(qū)域存在保守互補(bǔ)位點(diǎn)，見(jiàn)圖3。熒光素活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)顯示，miRNA-126模擬物與Twf1的3′-UTR核心序列重組體共反應(yīng)組的相對(duì)熒光表達(dá)為(33.68±12.57)%，低于內(nèi)對(duì)照載體組(n=6，P<0.01)。scr-miRNA與Twf1的3′-UTR核心序列重組體共反應(yīng)組的相對(duì)熒光表達(dá)為(97.75±12.84)%，與其突變重組為(98.30±14.58)%，miRNA-126模擬物與突變重組為(96.48±11.90)%，與內(nèi)對(duì)照載體組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=6，P>0.05)。

圖3 可保守互補(bǔ)位點(diǎn)位置

Western印跡法顯示，空白心肌細(xì)胞組的Twf1蛋白表達(dá)量為(0.42±0.08)、scr-miRNA轉(zhuǎn)染組為(0.38±0.07)、miRNA-126模擬物轉(zhuǎn)染組為(0.07±0.01)，miRNA-126模擬物轉(zhuǎn)染組低于其他兩組(n=4，t=11.356、10.058，均P<0.01)，見(jiàn)圖4。

1.空白心肌細(xì)胞組；2.scr-miRNA轉(zhuǎn)染組；3.miRNA-126模擬物轉(zhuǎn)染組，下圖同圖4 Western印跡法檢測(cè)心肌細(xì)胞Twf1蛋白表達(dá)

2.4miRNA-126對(duì)TnI磷酸化的影響 心肌細(xì)胞的p-cTnI蛋白表達(dá)量在miRNA-126模擬物轉(zhuǎn)染組為(0.23±0.02)，明顯低于空白心肌細(xì)胞組(0.35±0.05)和scr-miRNA轉(zhuǎn)染組(0.30±0.04，n=3，F(xiàn)=7.270，P=0.025)?？瞻仔募〖?xì)胞組cTnI蛋白表達(dá)量為(0.70±0.09)、scr-miRNA轉(zhuǎn)染組為(0.65±0.07)、miRNA-126模擬物轉(zhuǎn)染組為(0.75±0.08)，三組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=3，F(xiàn)=1.160，P=0.375)。見(jiàn)圖5。

圖5 Western印跡法檢測(cè)miRNA-126對(duì)TnI磷酸化的影響

3 討 論

miRNA-126具有調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子(VCAM)-1、維持內(nèi)皮細(xì)胞完整、參與細(xì)胞增殖等多種功能，表現(xiàn)出一定的內(nèi)皮細(xì)胞特異性〔15～17〕。謝瓊慧等〔18〕通過(guò)研究大鼠心搏驟停-心肺復(fù)蘇模型發(fā)現(xiàn)，與氣管切開(kāi)時(shí)比較，大鼠心肺復(fù)蘇后的血漿miRNA-126的相對(duì)表達(dá)量降低，對(duì)預(yù)測(cè)心肌損傷具有重要價(jià)值。Long等〔19〕研究顯示，急性心肌梗死患者血漿miRNA-126的水平較正常對(duì)照組顯著降低，且其低表達(dá)與急性心肌梗死患者預(yù)后不良密切相關(guān)。上述結(jié)果均表明，miRNA-126在多種心血管系統(tǒng)疾病中表達(dá)下調(diào)，而關(guān)于其在心肌細(xì)胞肥大中表達(dá)程度的研究較少。本研究結(jié)果提示miRNA-126是心肌細(xì)胞肥大的負(fù)向調(diào)節(jié)因子，對(duì)肥大心肌細(xì)胞有明顯的抑制和保護(hù)作用。

通常情況下，每個(gè)miRNA均存在數(shù)個(gè)靶基因，通過(guò)直接調(diào)控靶基因發(fā)揮各自不同的生物學(xué)功能。本研究通過(guò)miRNA-126靶基因的預(yù)測(cè)和驗(yàn)證顯示，Twf1為其靶基因。Twf1屬于一類(lèi)細(xì)胞骨架調(diào)控蛋白，能夠?qū)Π麅?nèi)actin纖維的長(zhǎng)度與排序進(jìn)行調(diào)控。而細(xì)胞骨架在心肌細(xì)胞中的功能作用包括維持細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、能量轉(zhuǎn)換、細(xì)胞增殖等。同時(shí)，細(xì)胞骨架為細(xì)胞中細(xì)胞器的定位及細(xì)胞蛋白合成與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸提供支持。除此以外，細(xì)胞骨架與離子通道蛋白等調(diào)控蛋白相連，如果細(xì)胞骨架發(fā)生改變，常常將直接影響其功能?，F(xiàn)已有研究證實(shí)細(xì)胞骨架與心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔20〕。本研究結(jié)果表明miRNA-126可以通過(guò)抑制Twf1的表達(dá)調(diào)控心肌細(xì)胞肥大的發(fā)生發(fā)展。

cTnI屬于一種結(jié)構(gòu)蛋白，其連接的Ca2+-TnC可結(jié)合細(xì)胞絲橫橋，提高活化數(shù)目和比例，抑制肌球蛋白。除此以外，cTnI還具有調(diào)節(jié)心肌收縮功能和舒張功能的作用。據(jù)相關(guān)報(bào)道，Twf1可通過(guò)cTnI的磷酸化改變心肌纖維性狀，影響心肌收縮特性，繼而引起心肌細(xì)胞肥大〔21〕。因Twf1與cTnI存在交互作用，而miRNA-126是Twf1的上游調(diào)節(jié)分子，因此推斷miRNA-126的表達(dá)水平與cTnI磷酸化存在密切關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果提示miRNA-126/ Twf1通路可明顯抑制cTnI磷酸化。