邱園妹,侯夢賞,王天寶,李 喆,李至春,李志國,蘇松坤

(福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)，福建 福州 350002)

學(xué)習(xí)和記憶是人和動物為了維持生存所具備的必要生物學(xué)功能.學(xué)習(xí)和記憶行為通常是腦部神經(jīng)參與的各種神經(jīng)生理和分子機制調(diào)控的結(jié)果.人們曾經(jīng)普遍認為生物個體的學(xué)習(xí)和記憶能力與其腦部發(fā)育的復(fù)雜程度呈正相關(guān)，即人或者一些大型動物相對于昆蟲具備更復(fù)雜和發(fā)達的大腦，在學(xué)習(xí)記憶能力方面要比昆蟲強.因此，早期的昆蟲學(xué)研究領(lǐng)域涉及昆蟲學(xué)習(xí)記憶的研究較少.但是，隨著蜜蜂、果蠅、螞蟻、蟋蟀、胡蜂等許多昆蟲學(xué)習(xí)記憶相關(guān)研究的增多，證實昆蟲同樣擁有優(yōu)秀的學(xué)習(xí)記憶能力[1-2].此外，由于昆蟲的神經(jīng)系統(tǒng)相對其他動物來說比較簡單，因此蜜蜂等昆蟲是目前被用于研究學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)神經(jīng)生理和分子機制的重要模型之一.

蜜蜂是自然界中重要的授粉者，是一種典型的社會性昆蟲.它們具有一系列復(fù)雜的學(xué)習(xí)和記憶行為，例如蜜蜂可以識別物體的色彩、形狀、氣味，可以在迷宮中被訓(xùn)練，甚至可以做簡單的加減法[3-5].勞動分工和級型分化是蜜蜂作為社會性昆蟲的典型特征[6-7].在正常的蜂群中，不具有生殖功能的工蜂隨著日齡的變化需要承擔(dān)巢內(nèi)巢外幾乎所有工作[8]，除了日齡因素之外，蜜蜂的勞動分工行為還與生活的巢內(nèi)外環(huán)境、個體發(fā)育狀況等密切聯(lián)系[9].在某些特殊情況下為了適應(yīng)蜂群的需要，工蜂可以加速、減緩或者逆轉(zhuǎn)分工行為[7].例如當(dāng)外界蜜粉源豐富，而蜂群中采集蜂數(shù)量較少時，日齡較小的內(nèi)勤蜂也能轉(zhuǎn)變職能而從事采集工作.

正常蜂群中，羽化出房的新蜂3日齡內(nèi)便可擔(dān)任巢內(nèi)的清潔工作，6日齡后王漿腺發(fā)達便可哺育小幼蟲，達到12日齡時主要從事清理巢脾、釀蜜、筑造巢脾等大部分巢內(nèi)工作，18日齡以后蜜蜂主要從事巢外工作，如尋找食物、采集花粉和花蜜等工作.無論蜜蜂工蜂從事巢內(nèi)或者巢外工作，都需要具備一定的定向和學(xué)習(xí)能力，特別是蜜蜂嗅覺學(xué)習(xí)能力，其在蜜蜂的行為活動中起到重要的作用并得到廣泛研究[10-12].在羽化出房后2～3 d，蜜蜂的嗅覺系統(tǒng)便發(fā)育成熟，并在個體間信息交流、聯(lián)想性學(xué)習(xí)以及采集食物定位等方面發(fā)揮著重要作用[13].本研究基于蜜蜂的嗅覺系統(tǒng)，通過伸吻反應(yīng)(proboscis extension reflex,PER)與氣味建立聯(lián)想性學(xué)習(xí)，進而比較不同日齡工蜂學(xué)習(xí)能力的差異.已有研究表明，蜜蜂工蜂在達到6日齡時才能擁有一定的學(xué)習(xí)能力[13].因此，本研究選用了6、12、18日齡的工蜂作為試驗對象，比較不同日齡工蜂學(xué)習(xí)能力差異.此外，比較分析與嗅覺學(xué)習(xí)相關(guān)基因在不同日齡蜜蜂頭部的表達差異.

1 材料與方法

1.1 供試蜜蜂

試驗蜜蜂為意大利蜜蜂工蜂(ApismelliferaL.)，來源于福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院試驗蜂場.從3個不同的群勢較強蜂群中分別提取1個老熟的封蓋子脾，并置于恒溫培養(yǎng)箱中(溫度34.5 ℃，相對濕度70%).每天采集并使用不同顏色油漆筆標(biāo)記剛出房工蜂，隨后將標(biāo)記好的工蜂放入原蜂群中.待標(biāo)記工蜂達到6、12和18日齡時，分別將它們用飼養(yǎng)盒收集并用于氣味聯(lián)想性學(xué)習(xí)試驗.

1.2 氣味學(xué)習(xí)試驗裝置

試驗裝置由抽氣扇、氣泵、Y形橡膠管、注射器筒和氣閥開關(guān)等組成(圖1).其中注射器筒內(nèi)放置滴有10 μL香葉醇(Geraniol，99%)的圓形濾紙片，通過打開氣閥讓氣流進入并帶出氣味.

圖1 氣味學(xué)習(xí)裝置Fig.1 Equipment for odor learning test

1.3 氣味聯(lián)想性學(xué)習(xí)

圖2 固定用于氣味學(xué)習(xí)訓(xùn)練的蜜蜂Fig.2 Fixed bees used for odor learning test

分別將采集的標(biāo)記蜜蜂轉(zhuǎn)移至透明小玻璃瓶中并置于冰上進行冷凍麻痹，待蜜蜂表現(xiàn)出明顯的行動遲緩現(xiàn)象，將其取出并用布基膠帶固定于特制銅管中，使其頭部露出且不可隨意轉(zhuǎn)動，吻部可自由活動(圖2).將固定好的蜜蜂置于恒溫培養(yǎng)箱中(溫度34.5 ℃，相對濕度70%)，2 h后用于氣味聯(lián)想性學(xué)習(xí)試驗.

在進行氣味聯(lián)想性學(xué)習(xí)試驗之前，使用糖水(1 g·mL-1)刺激工蜂觸角，淘汰對糖水刺激無伸吻反應(yīng)的工蜂，每個日齡組設(shè)置3組重復(fù)試驗.氣味聯(lián)想性學(xué)習(xí)試驗的訓(xùn)練方式參照Bitterman et al[10]創(chuàng)建的經(jīng)典PER學(xué)習(xí)模型.將工蜂置于距離出氣口處約2 cm處，使其接受9 s的空氣氣流刺激(排除氣流影響)；第9 秒時，單獨給予香葉醇氣味條件刺激(conditional stimuli,CS)，持續(xù)3 s；3 s后，繼續(xù)給予香葉醇氣味刺激并同時使用1 g·mL-1糖水非條件刺激(unconditional stimuli,US)其觸角2 s，喂食糖水2 s；第16 秒時，停止氣味和糖水刺激獎勵，單獨給予工蜂持續(xù)11 s的空氣氣流刺激.整個學(xué)習(xí)訓(xùn)練過程時長27 s.每次訓(xùn)練過程間隔10 min，每只工蜂重復(fù)訓(xùn)練4 次(T1、T2、T3、T4).在T2、T3、T4學(xué)習(xí)訓(xùn)練過程中，在單獨給予蜜蜂氣味刺激時，若工蜂3 s內(nèi)伸吻，則表明成功建立氣味聯(lián)想性學(xué)習(xí)，記為“+”，否則記為“-”.行為訓(xùn)練結(jié)束后立即將工蜂用液氮凍斃，并儲存于-80 ℃用于后續(xù)熒光定量PCR試驗.

1.4 學(xué)習(xí)相關(guān)基因的相對表達量

基于學(xué)習(xí)行為試驗結(jié)果，將成功建立氣味聯(lián)想性學(xué)習(xí)工蜂樣本歸類為氣味學(xué)習(xí)能力較強工蜂，未能成功建立氣味聯(lián)想性學(xué)習(xí)工蜂樣本歸類為氣味學(xué)習(xí)能力較差工蜂.在3個日齡組內(nèi)的兩類工蜂中各隨機抽取6個樣本.使用Trizol法分別提取這兩類工蜂頭部總RNA，并使用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA.以actin管家基因作為內(nèi)參基因，比較王漿主蛋白1(majorroyaljellyprotein1,Mrjp1)、氣味結(jié)合蛋白16(odorantbindingproteins16,Obp16)、氣味結(jié)合蛋白18(odorantbindingproteins18,Obp18)、突觸小泡胺轉(zhuǎn)運體(solutecarrier18A,SLC18A)等4個與工蜂學(xué)習(xí)相關(guān)基因在學(xué)習(xí)能力較強與較差工蜂頭部基因的相對表達量[18].qRT-PCR反應(yīng)體系(10 μL)：SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ酶5 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1,表1)各0.2 μL，cDNA 0.4 μL,無RNA酶水4.2 μL.反應(yīng)條件：預(yù)變性 95 ℃ 2 min；39個循環(huán)：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s；溶解曲線分析：65 ℃升溫至95 ℃(每5 s升高0.5 ℃).每個模板設(shè)置3次技術(shù)性重復(fù)，以無RNA酶水為模板設(shè)置陰性對照.

表1 本試驗所用引物對序列信息Table 1 Information on primer sequences used in the study

1.5 統(tǒng)計分析

根據(jù)伸吻反應(yīng)率繪制學(xué)習(xí)曲線，伸吻反應(yīng)率/%=成功建立聯(lián)想性學(xué)習(xí)工蜂數(shù)/試驗蜜蜂數(shù)×100.伸吻率數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，并用t-檢驗(SPSS 20.0)對不同日齡組之間的學(xué)習(xí)比例進行顯著性差異檢驗.計算4個目的基因相對表達量[14].分別對3個日齡組內(nèi)學(xué)習(xí)能力較強和學(xué)習(xí)能力較差工蜂頭部學(xué)習(xí)相關(guān)基因表達量進行顯著性差異檢驗(t-檢驗，SPSS 20.0).圖形繪制軟件為GraphPad Prism 5.

2 結(jié)果與分析

2.1 學(xué)習(xí)次數(shù)對不同日齡意蜂氣味學(xué)習(xí)行為的影響

試驗選用6、12、18日齡工蜂為試驗對象，在淘汰掉對50%糖水不反應(yīng)的工蜂后，每組用于氣味學(xué)習(xí)訓(xùn)練的工蜂數(shù)量N=34～43只.每只工蜂均進行4次學(xué)習(xí)訓(xùn)練過程，即T1、T2、T3、T4.在4次的學(xué)習(xí)訓(xùn)練過程中，3組不同日齡工蜂在第1次的訓(xùn)練中(T1)均未對香葉醇氣味刺激表現(xiàn)出伸吻反應(yīng)，且它們的伸吻反應(yīng)率均隨著學(xué)習(xí)訓(xùn)練次數(shù)的增加而增加，在T3、T4時趨向于平穩(wěn)(圖3).表明工蜂的氣味學(xué)習(xí)能力隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加而增強，訓(xùn)練3次即可達到穩(wěn)定的學(xué)習(xí)水平.6日齡組工蜂學(xué)習(xí)曲線始終處于12日齡組和18日齡組下方，12日齡組學(xué)習(xí)曲線與18日齡組幾近重合.在第2次至第4次訓(xùn)練過程中，6日齡工蜂的伸吻反應(yīng)率分別為30.83%、45.00%、52.5%；12日齡工蜂的伸吻反應(yīng)率分別為65.57%、81.52%、80.42%；18日齡工蜂的伸吻反應(yīng)率分別為63.29%、76.29%、81.66%.

2.2 不同日齡意蜂氣味學(xué)習(xí)行為比較分析

在4次訓(xùn)練完成后，6日齡工蜂的伸吻反應(yīng)率為52.50%，12日齡工蜂的伸吻反應(yīng)率為80.42%，18日齡工蜂的伸吻反應(yīng)率為81.66%(圖4).6日齡工蜂的氣味學(xué)習(xí)能力分別顯著低于12日齡工蜂(P<0.05)和18日齡工蜂(P<0.05).12日齡工蜂的氣味學(xué)習(xí)能力與18日齡工蜂的氣味學(xué)習(xí)能力無顯著性差異(P>0.05).結(jié)果表明，與日齡較大工蜂相比，6日齡工蜂尚不能表現(xiàn)出穩(wěn)定的氣味學(xué)習(xí)能力，在12日齡時已經(jīng)可以表現(xiàn)出穩(wěn)定的氣味學(xué)習(xí)能力.

圖3 不同日齡意大利工蜂伸吻反應(yīng)率Fig. 3 Proboscis reaction rate of worker bees at different ages

2.3 學(xué)習(xí)相關(guān)基因相對表達量分析

本研究以actin作為內(nèi)參基因，運用qRT-PCR技術(shù)檢測與學(xué)習(xí)相關(guān)的基因(Mrjp1、Obp16、Obp18、SLC18A)在3個日齡組內(nèi)學(xué)習(xí)能力較強和學(xué)習(xí)能力較差的工蜂頭部相對表達量.結(jié)果如圖5-7所示，6、12和18日齡組學(xué)習(xí)能力較強的工蜂頭部Mrjp1的相對表達量均顯著高于學(xué)習(xí)能力較弱的工蜂[P(6 d)<0.05，P(12 d)<0.001，P(18 d)<0.05].Obp16和Obp18在12日齡組表達差異均極顯著[P(Obp16)<0.001，P(Obp18)<0.001]，學(xué)習(xí)能力較強工蜂頭部的相對表達量顯著高于學(xué)習(xí)能力較弱工蜂，但是在6日齡和18日齡表達差異均不顯著(P>0.05).SLC18A只在18日齡組學(xué)習(xí)成功和未成功工蜂中表達差異顯著(P<0.05)，學(xué)習(xí)能力較強工蜂腦部的相對表達量顯著高于學(xué)習(xí)能力較弱工蜂.

*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001.圖5 學(xué)習(xí)能力較強(成功)與較差(未成功)6日齡工蜂頭部基因相對表達量Fig.5 Relative expression of learning-related genes in the heads of 6-day-old worker bees with strong (successful) or poor learning (failed) ability

*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001.圖6 學(xué)習(xí)能力較強(成功)與較差(未成功)12日齡工蜂頭部基因相對表達量Fig.6 Relative expression of learning-related genes in the heads of 12-day-old worker bees with strong (successful) or poor learning (failed) ability

*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001.圖7 學(xué)習(xí)能力較強(成功)與較差(未成功)18日齡工蜂頭部基因相對表達量Fig.7 Relative expression of learning-related genes in the heads of 18-day-old worker bees with strong (successful) or poor learning (failed) ability

3 討論

本試驗選用6、12和18日齡意大利工蜂作為研究對象，通過建立氣味聯(lián)想性學(xué)習(xí)比較它們的嗅覺學(xué)習(xí)能力.結(jié)果表明，6日齡組的學(xué)習(xí)能力弱于12日齡組和18日齡組，學(xué)習(xí)水平約50%.12日齡組的學(xué)習(xí)能力與18日齡組相當(dāng)，學(xué)習(xí)結(jié)果無差異顯著，2個日齡組的學(xué)習(xí)水平均達到約80%.本研究結(jié)果顯示，在一定日齡范圍內(nèi)，工蜂的嗅覺學(xué)習(xí)能力與日齡呈正相關(guān)關(guān)系.然而在工蜂日齡達到12日齡或更高日齡時，日齡對于工蜂學(xué)習(xí)能力的影響則較小.本研究中，12日齡組的工蜂學(xué)習(xí)能力也表現(xiàn)出和18日齡組工蜂學(xué)習(xí)能力相當(dāng)?shù)乃?一般情況下，6和12日齡工蜂屬于內(nèi)勤蜂，主要負責(zé)巢內(nèi)工作，18日齡時屬于外勤蜂，主要從事采集等巢外工作.此前有研究顯示，在某些情況下，還未達到外勤蜂日齡的工蜂會出現(xiàn)提前出巢采集的行為[15-16].這說明工蜂在未達到外勤蜂日齡時便可具備外出采集的能力，但因某些原因它們選擇了繼續(xù)從事巢內(nèi)工作.工蜂在達到一定日齡時便已做好隨時轉(zhuǎn)變職能成為外勤蜂的準(zhǔn)備，這也許是蜂群應(yīng)對緊急情況的防御機制.此外，覓食行為通常被認為是導(dǎo)致外勤蜂死亡率高于內(nèi)勤蜂的主要原因[8]，年輕的工蜂為了延長壽命保持群勢而盡量避免低日齡出巢工作.同時，當(dāng)工蜂處于12日齡或者更高日齡時，此時影響工蜂氣味學(xué)習(xí)能力可能主要是一些外界環(huán)境因素，例如病毒感染、殺蟲劑脅迫、營養(yǎng)不良等生物性、非生物性致病因子[17-19].此外，由于工蜂接受氣味學(xué)習(xí)訓(xùn)練的次數(shù)是4次，12、18日齡組工蜂均表現(xiàn)出較高且穩(wěn)定的學(xué)習(xí)能力，而6日齡組工蜂是否可能需要接受更多次數(shù)的學(xué)習(xí)訓(xùn)練才能達到類似的學(xué)習(xí)水平，有待于后續(xù)進一步研究.

Mrjp1是編碼王漿主蛋白1的基因，Obp16和Obp18是2種氣味結(jié)合蛋白基因，SLC18A是一種突觸小泡胺轉(zhuǎn)運體基因，他們都已被證明參與工蜂氣味學(xué)習(xí)的過程[18,20].前人研究表明Mrjp1在工蜂腦部的蘑菇體中高表達，蘑菇體是涉及工蜂學(xué)習(xí)與記憶行為的神經(jīng)中樞[21].本研究中，Mrjp1在3個日齡組內(nèi)學(xué)習(xí)能力較強的個體相對表達量均高于學(xué)習(xí)能力較弱的個體，且在學(xué)習(xí)能力較強工蜂頭部均表現(xiàn)出顯著高水平表達.此外，另外3個與嗅覺學(xué)習(xí)相關(guān)的基因在理論上應(yīng)當(dāng)與Mrjp1一致，在各個日齡組的學(xué)習(xí)能力較強者都呈現(xiàn)出高表達量，但是試驗結(jié)果與預(yù)期不一致，這進一步證明了Mrjp1可能是工蜂腦部成功建立氣味聯(lián)想性學(xué)習(xí)的關(guān)鍵基因，但具體的調(diào)控機制尚不清楚，需要進一步探索.SLC18A在生物體腦部貯存和釋放多巴胺、五羥色胺等神經(jīng)遞質(zhì)過程中不可或缺，在果蠅的學(xué)習(xí)和記憶過程中起著重要作用[22].在本研究中，SLC18A在18日齡組學(xué)習(xí)能力較強工蜂中顯著高表達.由于18日齡組工蜂一般已開始從事巢外工作，采集蜂不僅需要具備嗅覺學(xué)習(xí)能力，還需要具備導(dǎo)航、定位等能力，其學(xué)習(xí)機制更為復(fù)雜.SLC18A可能不僅僅參與工蜂的氣味學(xué)習(xí)過程，更可能同時調(diào)控其他的學(xué)習(xí)或記憶過程，呈現(xiàn)顯著性下調(diào)表達的學(xué)習(xí)能力較弱工蜂或許在從事采集等巢外工作時亦會表現(xiàn)出較弱的導(dǎo)航、定向等其他能力.Obp16和Obp18這兩種氣味結(jié)合蛋白基因只在12日齡組不同學(xué)習(xí)狀態(tài)工蜂中差異表達極顯著.已有研究顯示，工蜂在0～8日齡對于氣味的敏感性一直在增強，而在8～15日齡則處于下降狀態(tài)，此后敏感性處于穩(wěn)定狀態(tài)且低于8～15日齡[23].另外，Ray et al[13]研究表明，達到10日齡的工蜂更傾向于離開巢脾，對外界環(huán)境表現(xiàn)出探索性行為.12日齡組工蜂對于氣味的敏感性更高可能正是由于這種探索性行為，從而對氣味表現(xiàn)出強烈的反應(yīng)，這可能也是Obp16和Obp18在學(xué)習(xí)能力較強的工蜂腦部呈現(xiàn)高表達的原因.以上說明，不同的學(xué)習(xí)相關(guān)基因在工蜂不同的發(fā)育階段參與其嗅覺學(xué)習(xí)過程時也會隨著日齡呈現(xiàn)出不同的表達模式.

綜上表明，日齡對于工蜂的學(xué)習(xí)能力有一定的影響，但并不是工蜂學(xué)習(xí)能力的決定性因素.隨著工蜂日齡的增長，勞動分工行為的轉(zhuǎn)變和蜂群內(nèi)外各種環(huán)境和生物因子的交互作用，最終可能影響工蜂的氣味學(xué)習(xí)行為以及相關(guān)的調(diào)控機制.在蜂群內(nèi)外復(fù)雜環(huán)境和生物因子存在的前提下，日齡、勞動分工和學(xué)習(xí)行為三者之間的交互作用及調(diào)節(jié)工蜂腦部活動的具體機制，仍需要進一步探索.