魏鑫，王寒濤，魏恒玲，付小康，馬亮，蘆建華，王省芬，喻樹(shù)迅

（1河北農(nóng)業(yè)大學(xué)/棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室河北基地，河北保定 071001；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南安陽(yáng) 455000）

0 引言

【研究意義】棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物，經(jīng)常遭受干旱、鹽堿等惡劣環(huán)境條件的影響，造成棉花產(chǎn)量和品質(zhì)下降。當(dāng)植物受到干旱脅迫后，會(huì)啟動(dòng)一系列干旱脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，從分子水平、細(xì)胞水平以及生理生化水平做出相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)干旱脅迫的抗逆反應(yīng)[1-2]。轉(zhuǎn)錄因子通常作為一類調(diào)控因子參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育及干旱等各種脅迫應(yīng)答過(guò)程，因此對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的功能進(jìn)行研究具有重要意義[3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，由1個(gè)或2個(gè)WRKY保守結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，N端是一段高度保守的序列（WRKYGQK），由大約60個(gè)保守的氨基酸殘基組成，而 C端是鋅指結(jié)構(gòu)（CX4-5CX22-23HX1H或 CX7CX23HX1C）[4-5]。根據(jù)保守的WRKY結(jié)構(gòu)域數(shù)量和鋅指序列不同的特點(diǎn)，可將WRKY蛋白歸為3組。Ⅰ組有2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)類型為 C2H2，Ⅱ組和Ⅲ組包含 1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)類型分別為C2H2和C2HC。根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的進(jìn)化關(guān)系和某些氨基酸基序，Ⅱ組又可以分為5個(gè)亞組：Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd和Ⅱe[6-8]。前人研究表明，許多 WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、各種脅迫反應(yīng)中具有重要作用[9-12]，尤其在干旱脅迫中充當(dāng)著十分重要的角色。CHU等[13]通過(guò)將陸地棉GhWRKY41轉(zhuǎn)化煙草，發(fā)現(xiàn)該基因過(guò)量表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性水平，且干旱條件下植株的丙二醛含量降低，抗氧化酶活性增強(qiáng)，促進(jìn)了氣孔的關(guān)閉。煙草中過(guò)表達(dá)GhWRKY25，干旱條件下丙二醛、活性氧含量升高，超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶活性降低，植株抗旱能力下降[14]。在擬南芥中，AtWRKY44通過(guò)糖信號(hào)通路調(diào)控其對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)[15]；過(guò)表達(dá)AtWRKY57提高了擬南芥的抗旱性和耐鹽性[16]；AtWRKY46被證實(shí)調(diào)節(jié)干旱和鹽脅迫，且參與調(diào)節(jié)光依賴性的氣孔開(kāi)放[17]。MtWRKY76的過(guò)表達(dá)顯著提高了轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性[18]。在葡萄中，VIWRKY48在干旱脅迫下也被證明能夠提高過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化物歧化酶的抗氧化酶活性，不僅增加了葡萄的抗旱性，同時(shí)在抗白粉病中也發(fā)揮著重要作用[19]。【本研究切入點(diǎn)】棉花是非常重要的經(jīng)濟(jì)作物，但其產(chǎn)量和品質(zhì)嚴(yán)重受到干旱、鹽堿的影響。WRKY轉(zhuǎn)錄因子作為植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，與眾多的非生物脅迫相關(guān)，但在棉花中與干旱相關(guān)的研究較少?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)克隆棉花GhWRKY33，并進(jìn)行亞細(xì)胞定位，分析其在干旱及不同激素處理下的表達(dá)模式，在擬南芥中過(guò)量表達(dá)，明確其在抗旱中的作用，為棉花抗旱機(jī)制解析及分子育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

棉花材料中棉所 10號(hào)以及擬南芥哥倫比亞野生型（Col-0生態(tài)型）均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所早熟課題組提供。

表1 研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2 GhWRKY33的克隆

通過(guò)在線網(wǎng)站CottonFGD（https://cottonfgd.org/）搜索并下載陸地棉GhWRKY33的 CDS序列，使用Oligo 7.0軟件設(shè)計(jì)特異引物（GhWRKY33-F/R），以陸地棉中棉所10號(hào)葉片組織為材料，利用北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)的 RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA快速提取盒提取RNA，Nanodrop2000核酸分析儀測(cè)定RNA的純度和濃度，10 mg·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) RNA完整性；使用 TaKaRa公司的PrimerScript RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用GhWRKY33-F、GhWRKY33-R引物擴(kuò)增得到GhWRKY33，PCR體系為 2×Spark Buffer 25 μL、dNTP 1 μL、上下游引物各 2 μL、cDNA 2 μL、Ploymerase 1 μL、無(wú)菌水 17 μL，反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 30 s；95℃ 15 s，72℃ 15 s，72℃ 90 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物回收、純化，送河南尚亞生物技術(shù)公司測(cè)序，從而獲得序列正確的GhWRKY33片段。

1.3 生物信息學(xué)分析

使用 SOPMA分析蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；使用ProtScale（http://web.expasy.org/protscale）預(yù)測(cè)蛋白的親疏水性；使用NetPhos2.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-2.0/）預(yù)測(cè)蛋白的磷酸化位點(diǎn)；通過(guò) PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對(duì)基因上游2 000 bp序列進(jìn)行分析；通過(guò)NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中BLASTP搜索與該基因同源性較高的序列，并利用MEGA X中鄰近法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，bootstrap值設(shè)置為1 000；利用DNAMAN V6進(jìn)行多重序列比對(duì)。

1.4 GhWRKY33的亞細(xì)胞定位

利用MEGA 6.0設(shè)計(jì)引物GhWRKY33-GFP-F/R,以pBI121-GhWRKY33過(guò)表達(dá)載體質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴(kuò)增，用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、SpeⅠ對(duì)pBI121-GFP載體進(jìn)行雙酶切，利用同源重組法構(gòu)建融合蛋白瞬時(shí)表達(dá)載體35S::GhWRKY33-GFP，通過(guò)農(nóng)桿菌滲透法將融合表達(dá)載體注射到本氏煙草葉片中，同時(shí)注射pBI121-GFP載體作為對(duì)照，暗培養(yǎng)24 h后再在正常條件下培養(yǎng)24 h，利用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光信號(hào)。

1.5 GhWRKY33的組織表達(dá)模式分析

為了研究GhWRKY33的組織表達(dá)模式，在開(kāi)花期取中棉所10號(hào)的根、莖、葉片、雄蕊、雌蕊、頂芽、花瓣、萼片等組織，利用多糖多酚植物 RNA提取試劑盒提取各組織的 RNA，反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，使用ABI7500 Real Time PCR Systerm進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)，反應(yīng)體系為2×Ultra SYBR Mixture 10 μL、Primer F 0.4 μL、Primer R 0.4 μL、cDNA 0.8 μL、ddH2O 8.4 μL。反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 32 s；95℃ 15 s，60℃ 1 min；95℃ 30 s，60℃ 15 s，30個(gè)循環(huán)。每種組織取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，并進(jìn)行3次獨(dú)立的試驗(yàn)，使用相對(duì)定量法2-ΔΔCt[20]進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.6 不同激素處理和干旱脅迫下的基因表達(dá)分析

將中棉所10號(hào)種植于溫室，正常生長(zhǎng)至3葉期，對(duì)棉苗進(jìn)行激素和干旱處理。激素處理：分別取茉莉酸（100 μmol·L-1）、脫落酸（100 μmol·L-1）、乙烯（0.2%ET）溶液各10 mL，均勻噴灑至葉片表面；干旱處理：用自來(lái)水將棉苗的根沖洗干凈后，將棉苗放置于錐形瓶中，加入18%的PEG6000溶液100 mL模擬干旱。每個(gè)處理選取5株棉苗，在處理后0、3、6、12、24和48 h時(shí)取樣，用于基因表達(dá)分析，qRT-PCR反應(yīng)體系和條件同1.4所述。

1.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得

將pBI121載體線性化，其酶切位點(diǎn)上游為XbaⅠ、下游為SacⅠ，利用同源重組的方法將目的片段與載體連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，通過(guò)菌液PCR驗(yàn)證為陽(yáng)性菌落后，送河南尚亞生物技術(shù)公司測(cè)序，從而獲得序列正確的GhWRKY33片段。

通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥。將侵染后的擬南芥暗培養(yǎng)24 h，然后轉(zhuǎn)移至正常條件培養(yǎng)室培養(yǎng)，一個(gè)月左右收獲擬南芥種子，將種子30℃烘干2 d，用1% NaClO、75%的乙醇消毒，滅菌ddH2O清洗5次以上，平鋪至含有卡那霉素的 1/2MS培養(yǎng)板，4℃春化2 d，放置22℃、16 h光照/8 h黑暗的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)篩選陽(yáng)性植株，之后單株收獲，以同樣的方法篩選直至獲得T3代純合株系。

1.8 轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性鑒定

1.8.1 干旱處理后擬南芥性狀鑒定 分別取少量的Col-0野生型、3個(gè)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系OE-1、OE-2、OE-3種子灑在營(yíng)養(yǎng)土中，一周之后挑選生長(zhǎng)狀態(tài)一致的幼苗移栽至營(yíng)養(yǎng)缽中，每個(gè)株系移栽3盆，每盆4棵苗，作為重復(fù)，正常生長(zhǎng) 2周左右，使用 20%的PEG6000溶液澆灌根系，每盆大約150 mL，處理12 h后觀察野生型Col-0、轉(zhuǎn)基因株系OE-1、OE-2、OE-3的萎蔫情況。

1.8.2 脯氨酸含量測(cè)定 抗旱性強(qiáng)的植株會(huì)積累較多的脯氨酸，可以作為抗旱鑒定的指標(biāo)之一。取干旱處理的野生型和 3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的擬南芥葉片約 0.1 g，對(duì)照組和試驗(yàn)組均取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，按照試劑盒所述步驟操作：加入1 mL磺基水楊酸冰浴勻漿，沸水浴震蕩10 min，10 000 r/min常溫離心10 min，取上清靜置冷卻，取0.5 mL上清加入冰乙酸，0.5 mL脯氨酸提取液，沸水浴30 min，10 min震蕩一次；冷卻后加入1 mL甲苯震蕩30 s，靜置片刻，使色素轉(zhuǎn)移至甲苯，于520 nm波長(zhǎng)處比色，記錄吸光值。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品1 mg，分別配制為15、10、8、6、4、2、1和0 μg·mL-1，其余操作同樣品的處理方法。

“圖”是最直觀的語(yǔ)言，最大的特點(diǎn)是可視化，將思維的過(guò)程和特征記錄、固定下來(lái)，是一種化繁為簡(jiǎn)的思維方式。傳統(tǒng)復(fù)習(xí)課主要針對(duì)中檔學(xué)生，學(xué)困生畏難無(wú)趣、學(xué)優(yōu)生不屑一顧，枯燥低效，繪圖讓人人參與，需要更深層次的思維拓展，激發(fā)了學(xué)困生的興趣、學(xué)優(yōu)生的潛能，取得多贏的局面。

1.8.3 丙二醛含量測(cè)定 丙二醛作為質(zhì)膜過(guò)氧化的產(chǎn)物之一，與植物耐旱性呈負(fù)相關(guān)，也可作為耐旱性指標(biāo)之一。取野生型和3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的擬南芥葉片0.1 g，每組樣品取3個(gè)重復(fù)，按照試劑盒所述步驟操作：將組織放到研缽中加入 1 mL提取液冰浴勻漿，8 000 r/min 4℃離心10 min，取上清置冰上待測(cè)；測(cè)定管中依次加入MDA檢測(cè)工作液300 μL、樣本100 μL、試劑三100 μL，空白管依次加入MDA監(jiān)測(cè)工作液 300 μL、蒸餾水 100 μL、試劑三 100 μL；混合液在100℃水浴保溫60 min，冰浴冷卻，10 000 r/min常溫離心10 min，取200 μL上清，測(cè)定各樣品在450、532和 600 nm 處吸光度，計(jì)算 ΔA450=A450測(cè)定-A450空白、ΔA532=A532測(cè)定-A532空白、ΔA600=A600測(cè)定-A600空白。最終含量計(jì)算公式：MDA（nmol·mg-1）=5[6.45×(ΔA532-ΔA600)-0.56×ΔA450]/W。

2 結(jié)果

2.1 GhWRKY33的克隆與生物信息學(xué)分析

提取陸地棉中棉所 10號(hào)總 RNA，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的片段與預(yù)期大小一致，約1 500 bp（圖1），純化后轉(zhuǎn)入大腸桿菌并提取質(zhì)粒。測(cè)序后，目的基因ORF全長(zhǎng)1 533 bp，編碼510個(gè)氨基酸殘基，與參考基因組TM-1編號(hào)為Gh_D04G1318[21]的序列相似性達(dá)100%。

圖1 GhWRKY33的PCR擴(kuò)增Fig. 1 PCR amplification of GhWRKY33

圖2 GhWRKY33編碼蛋白的生物信息學(xué)分析Fig. 2 Bioinformatic analysis of GhWRKY33

SOPMA預(yù)測(cè)表明（圖2-A），GhWRKY33蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)α螺旋（alpha helix）包含49個(gè)氨基酸殘基，占 9.61%；延伸鏈（extened strand）的氨基酸殘基有47個(gè)，占9.22%；β-轉(zhuǎn)角（beta turn）包含14個(gè)氨基酸殘基，占 2.75%；無(wú)規(guī)則卷曲（random coil）包含400個(gè)氨基酸殘基，占78.43%，推測(cè)該蛋白的功能域主要由無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成。GhWRKY33蛋白含有26個(gè)蘇氨酸（threonine）磷酸化位點(diǎn)（圖 2-B），可能與磷酸化調(diào)控有密切關(guān)系。親疏水性分析顯示（圖2-C），親水蛋白所占比例較大，屬于親水蛋白，其親水性平均系數(shù)為-1.180。

使用PlantCARE軟件對(duì)基因上游2 000 bp序列分析，發(fā)現(xiàn)存在多個(gè)順式作用元件（表 2）。如參與脫落酸調(diào)控反應(yīng)的元件 ABER、參與光反應(yīng)的元件G-box、參與干旱脅迫響應(yīng)的MYB結(jié)合位點(diǎn)、與植物組織分生表達(dá)相關(guān)的元件CAT-box等。

2.2 GhWRKY33蛋白同源比對(duì)及進(jìn)化分析

利用NCBI在線數(shù)據(jù)庫(kù)，選取多條相似度較高的WRKY蛋白與GhWRKY33進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示目的蛋白有2個(gè)WRKYGQK保守域，且鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2，屬于第Ⅰ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子（圖3）。進(jìn)一步構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖4），結(jié)果顯示，其與GrWRKY33同源關(guān)系最近，同源性達(dá)到了99%，其次是擬南芥等，而與大豆的同緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.3 GhWRKY33的組織特異性表達(dá)分析

以中棉所10號(hào)開(kāi)花期的根、雄蕊、雌蕊、頂芽、葉片、莖、花瓣、萼片等組織為材料，對(duì)GhWRKY33進(jìn)行組織特異性表達(dá)分析。結(jié)果顯示，GhWRKY33具有明顯的組織表達(dá)特異性，在芽中的表達(dá)量最高，其次是在雄蕊、雌蕊、葉片等組織，在根和莖中表達(dá)量最低（圖5）。

表2 GhWRKY33啟動(dòng)子序列分析Table 2 Sequence analysis of GhWRKY33 gene promoter

2.4 干旱和不同激素處理?xiàng)l件下基因的表達(dá)分析

qRT-PCR結(jié)果表明，該基因表達(dá)受到PEG、乙烯、茉莉酸、脫落酸的誘導(dǎo)。隨著PEG、乙烯、茉莉酸處理時(shí)間的推移，該基因的表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，在48 h達(dá)到高峰（圖6-A、圖6-B和圖6-C）；脫落酸處理24 h內(nèi)，基因的表達(dá)變化趨勢(shì)不明顯，但48 h時(shí)基因的表達(dá)量急劇上升，較之前的各時(shí)間點(diǎn)上升了10倍左右（圖6-D）。

2.5 GhWRKY33的亞細(xì)胞定位分析

以 pBI121-GFP空載體為對(duì)照，將其與融合表達(dá)載體35S::GhWRKY33-GFP通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)分別轉(zhuǎn)入本氏煙草。結(jié)果顯示，對(duì)照組在細(xì)胞核和細(xì)胞膜上均出現(xiàn)綠色熒光信號(hào)，而融合蛋白 35S::GhWRKY33-GFP只在細(xì)胞核中有綠色熒光信號(hào)（圖7），表明該基因定位于細(xì)胞核中。

2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性鑒定及抗旱相關(guān)生理生化指標(biāo)分析

選取GhWRKY33表達(dá)量相對(duì)較高（圖 8）的 3個(gè)T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥株系OE-1、OE-2、OE-3與野生型擬南芥同時(shí)澆灌等量的20% PEG6000溶液，發(fā)現(xiàn)12 h后野生型擬南芥和3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系都發(fā)生不同程度萎蔫，但是野生型較轉(zhuǎn)基因株系萎蔫程度更加嚴(yán)重（圖 9），表明基因過(guò)量表達(dá)可以提高擬南芥的抗旱性水平。

圖3 GhWRKY33與其他物種WRKY蛋白序列比對(duì)分析Fig. 3 Sequence alignment of GhWRKY33 and WRKY proteins of other species

圖4 不同WRKY蛋白的進(jìn)化樹(shù)分析Fig. 4 Phylogenetic analysis of different WRKY proteins

圖5 GhWRKY33組織特異性表達(dá)分析Fig. 5 Tissue specific expression analysis of GhWRKY33

圖6 不同處理下GhWRKY33的表達(dá)模式Fig. 6 Expression patterns of GhWRKY33 under different treatments

圖7 35S::GhWRKY33-GFP融合蛋白的亞細(xì)胞定位Fig. 7 Subcellular localization of 35S::GhWRKY33-GFP fusion protein

圖8 轉(zhuǎn)基因擬南芥GhWRKY33的熒光定量表達(dá)分析Fig. 8 Quantitative expression level of GhWRKY33 gene in transgenic Arabidopsis

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定數(shù)據(jù)，建立脯氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖10-A）。野生型擬南芥的吸光度為0.409，轉(zhuǎn)基因擬南芥 3個(gè)株系的吸光度分別為 1.604、1.362和1.411，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到野生型和3個(gè)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的脯氨酸含量分別為3.843和26.875、22.062和22.997 μg·mL-1（圖9-B），表明轉(zhuǎn)基因株系的脯氨酸含量在干旱脅迫后極顯著高于野生型。

丙二醛的測(cè)定結(jié)果表明，野生型擬南芥丙二醛含量為29.885 nmol·g-1，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中丙二醛含量為8.813、10.329 和 6.997 nmol·g-1，均極顯著低于野生型（圖11）。

2.7 GhWRKY33影響與干旱響應(yīng)相關(guān)的基因表達(dá)

為了進(jìn)一步研究GhWRKY33在干旱脅迫信號(hào)通路中的作用，鑒定了野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥在PEG處理前后干旱響應(yīng)基因AtRD29A、AtCOR15A、AtP5CS與GhWRKY33的表達(dá)水平（圖 12）。結(jié)果顯示，正常生長(zhǎng)條件下，野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥中，AtRD29A、AtCOR15A和AtP5CS的表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異，但在20%的PEG6000處理后，這些基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)量均極顯著提高，表明植株受到干旱脅迫后，通過(guò)誘導(dǎo)GhWRKY33上調(diào)表達(dá)，進(jìn)而正向調(diào)控干旱響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，最終提高了轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性水平。

3 討論

圖9 PEG6000處理12 h野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥生長(zhǎng)狀態(tài)Fig. 9 Growth of wild-type and transgenic Arabidopsis thaliana treated with PEG6000 for 12 h

圖10 野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥干旱處理12 h脯氨酸含量Fig. 10 Proline contents of wild-type and transgenic lines under drought treatment for 12 h

本研究從陸地棉中克隆了GhWRKY33，序列分析發(fā)現(xiàn)目的基因包含1 533 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼510個(gè)氨基酸殘基，與其他WRKY蛋白序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)該基因有2個(gè)WRKYGQK保守結(jié)構(gòu)域，鋅指蛋白為C2H2型，證明該基因?qū)儆诘谝活怶RKY轉(zhuǎn)錄因子。在GhWRKY33中親水蛋白占很大比重，使得該蛋白具有較強(qiáng)的親水性，這種親水性能夠保持細(xì)胞的水分含量，也可以防止與其他蛋白脫水或凝聚[22]。在二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中，GhWRKY33蛋白中存在的 α-螺旋，該結(jié)構(gòu)的存在保障蛋白的柔韌性和流動(dòng)性，在一定逆境下會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)變異[23]，在受到干旱脫水影響時(shí)在一定程度上可以降低細(xì)胞所受傷害，這些蛋白結(jié)構(gòu)的特性為該基因的抗旱性研究提供了一定的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，亞細(xì)胞定位結(jié)果表明基因表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞核內(nèi)行使功能。通過(guò)對(duì)GhWRKY33的啟動(dòng)子區(qū)域的順式元件分析，發(fā)現(xiàn)存在與干旱響應(yīng)相關(guān)的MYB結(jié)合位點(diǎn)，并且在干旱處理下該基因的表達(dá)模式分析，證明其參與干旱脅迫相關(guān)的生物過(guò)程。

許多研究證明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子受到外源激素的影響。陸地棉GhWRKY41可以通過(guò)ABA信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)植物的氣孔關(guān)閉以及調(diào)節(jié) ROS的表達(dá)水平響應(yīng)干旱和鹽脅迫反應(yīng)[13]；GhWRKY17被 ABA、H2O2、鹽和干旱所誘導(dǎo)，在煙草中過(guò)量表達(dá)顯著減低植株的耐鹽性和耐旱性，證明了其通過(guò) ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)植物中ROS的含量進(jìn)而調(diào)控對(duì)鹽和干旱的反應(yīng)[24]；煙草中，TaWRKY1依賴ABA途徑調(diào)節(jié)氣孔活動(dòng)，保證水分的含量來(lái)抵御干旱，ABA受體基因NtPYL8在該信號(hào)通路中的傳導(dǎo)作用至關(guān)重要[25]；菊花中過(guò)表達(dá)CmWRKY1，與野生型相比，增加了植株對(duì)聚乙二醇的耐受性，并且初步證明是通過(guò) ABA信號(hào)通路響應(yīng)干旱誘導(dǎo)[26]；GmWRKY20在轉(zhuǎn)基因擬南芥中增加了對(duì)ABA的敏感性，進(jìn)而提高了對(duì)干旱脅迫的耐受性[27]。本研究分析了GhWRKY33在受到乙烯、茉莉酸和脫落酸誘導(dǎo)后的表達(dá)模式，結(jié)果表明，基因的表達(dá)量都呈現(xiàn)出顯著的上調(diào)，推測(cè)該基因可能參與茉莉酸、乙烯以及脫落酸信號(hào)傳導(dǎo)途徑，進(jìn)而參與調(diào)控植物的抗逆反應(yīng)。

圖11 野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥干旱處理12 h丙二醛含量比較Fig. 11 MDA content of wild-type and transgenic lines under drought treatment for 12 h

圖12 野生型與轉(zhuǎn)基因株系中干旱脅迫相關(guān)基因的表達(dá)Fig. 12 Expression analyses of the genes related to drought stress in the wild-type and transgenic lines

前人研究表明，1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）是參與脯氨酸合成的關(guān)鍵酶，而脯氨酸可以穩(wěn)定原生質(zhì)體膠體中的代謝過(guò)程并防止細(xì)胞脫水，通過(guò)增強(qiáng)P5CS的酶活性進(jìn)而增加脯氨酸的生物合成，提高植物的抗逆性[28-29]。RD29A編碼親水蛋白，可以被ABA、干旱等脅迫誘導(dǎo)表達(dá)[30]。COR15A是干旱脅迫中的標(biāo)志基因，通過(guò)ABA信號(hào)誘導(dǎo)參與干旱脅迫響應(yīng)[31]。為了進(jìn)一步了解GhWRKY33調(diào)控機(jī)制，本研究檢測(cè)了干旱響應(yīng)基因AtP5CS（AT2G39800）、AtRD29A（AT5G52310）、AtCOR15A（AT2G42540）在20%PEG6000處理前后的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)這些基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)較野生型顯著升高，因此，推測(cè)GhWRKY33通過(guò) ABA信號(hào)通路正向調(diào)控AtRD29A、AtCOR15A和AtP5CS的表達(dá)，從而提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性水平。關(guān)于GhWRKY33在棉花中的抗旱分子機(jī)制今后還需要進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

從陸地棉中克隆獲得GhWRKY33，屬于典型的第Ⅰ類 WRKY轉(zhuǎn)錄因子，其編碼蛋白屬于親水蛋白；在頂芽中表達(dá)量最高，具有明顯的組織表達(dá)特異性；GhWRKY33定位于細(xì)胞核；該基因響應(yīng)干旱、乙烯、茉莉酸、脫落酸等的誘導(dǎo)。推測(cè)GhWRKY33作為正調(diào)控因子通過(guò)ABA信號(hào)通路調(diào)控?cái)M南芥的抗旱性。