趙久然，李春輝，宋偉，劉新香，王元東，張如養(yǎng)，王繼東，孫軒，王夏青

（北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心/玉米DNA指紋及分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100097）

0 引言

【研究意義】骨干自交系的形成和有效利用對作物遺傳育種進(jìn)程具有重要的推動作用[1]。選自地方品種塘四平頭的骨干自交系黃早四[2]，開創(chuàng)了中國緊湊型玉米育種新局面，利用黃早四衍生出眾多優(yōu)良自交系，包括昌7-2、Lx9801、京24、京2416等[3-5]。其中，優(yōu)良自交系京2416是在中國玉米籽粒機(jī)收重大產(chǎn)業(yè)需求背景下育成的，具有耐密植抗倒伏、抗病抗逆性強(qiáng)、適宜區(qū)域廣、早熟脫水快、自身產(chǎn)量及配合力高等多方面優(yōu)點(diǎn)，已成為當(dāng)前中國廣泛利用的重要骨干自交系之一。利用京 2416組配選育出京農(nóng)科728、京農(nóng)科 828、NK718、MC121、MC812等 21個優(yōu)良玉米新品種（電子附表1），具有高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、多抗廣適、易制種等綜合優(yōu)點(diǎn)，已在生產(chǎn)上累計推廣300萬hm2以上。其中，京農(nóng)科728突破了黃淮海夏玉米籽粒機(jī)收技術(shù)瓶頸，成為中國首批通過國家審定的機(jī)收籽粒品種，引領(lǐng)夏玉米機(jī)收籽粒育種方向[6-8]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】京2416是通過優(yōu)良黃改群自交系京24和5237遺傳重組形成的。重組是基因組進(jìn)化的重要驅(qū)動力之一，可以增強(qiáng)物種的遺傳多樣性。通過重組實(shí)現(xiàn)多態(tài)位點(diǎn)重新排列，從而有機(jī)會獲得新的、更優(yōu)良等位基因組合，對作物育種具有重大貢獻(xiàn)[9]。高通量芯片和測序技術(shù)的發(fā)展，使重現(xiàn)骨干親本形成過程中的重組事件成為可能[9-12]。近年來，對玉米骨干自交系遺傳重組進(jìn)行了大量的研究。LAI等[10]對6個玉米骨干自交系（沈5003、掖478、鄭58、昌7-2、178和Mo17）進(jìn)行了全基因組測序，通過同源傳遞片段（identity-by-descent，IBD）分析證實(shí)自交系8112、沈5003、掖478和鄭58之間的關(guān)系，重現(xiàn)了鄭58形成過程中的重組事件。WU等[12]利用高通量芯片構(gòu)建了黃改系的精細(xì)重組圖譜，發(fā)現(xiàn)了15個遺傳傳遞保守基因組區(qū)域。PAN等[9]利用骨干自交系形成的12個分離群體，解析了染色體上重組頻率的分布和變化規(guī)律，并鑒定到 143個重組熱點(diǎn)區(qū)域。ZHANG等[11]利用高密度芯片重現(xiàn)了黃早四和14份黃改系的重組事件，確定了每個黃改系的重組事件次數(shù)，并通過IBD分析對鄭58未知親本進(jìn)行推測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未知親本含有自交系丹340的同源染色體片段，使鄭58形成過程的重組信息進(jìn)一步細(xì)化。LI等[13]利用黃早四親代及后代衍生系全基因組測序數(shù)據(jù)重現(xiàn)了黃早四及黃改系的形成歷史，發(fā)現(xiàn) 862個IBD保守區(qū)域，并且超過60%的IBD保守區(qū)域中存在選擇信號，在這些選擇區(qū)域中富集了大量的產(chǎn)量性狀相關(guān) QTL?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】隨著近年來優(yōu)良玉米雜交種的審定與推廣，大量優(yōu)異的自交系得以培育，但對于京2416這一優(yōu)新自交系并未進(jìn)行系統(tǒng)地遺傳解析。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究通過分析京2416形成過程中的重組事件和黃早四基因組片段傳遞規(guī)律，解析京2416和X群[14-15]（由X1132x等雜交種構(gòu)建的基礎(chǔ)材料選育出的優(yōu)新種質(zhì)）代表系高配合力的遺傳基礎(chǔ)，以期為黃改系的遺傳改良提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用4份優(yōu)異黃改群自交系（黃早四及其衍生系京2416、京24和5237）為試驗(yàn)材料。其中，京2416為京24和5237同群優(yōu)系聚合選系。另外選用5份X群代表性自交系京724、京464、DH382、京725和京MC01作為測驗(yàn)種，對4份黃改系進(jìn)行雜種優(yōu)勢分析。系譜來源見表1。

表1 9份自交系及其系譜來源Table 1 Name and pedigree source of 9 inbred lines

1.2 雜交組合的配制及田間鑒定

采用NCII遺傳設(shè)計將上述4份黃改系和5份X系組配20個雜交組合，于2016年在黃淮海、東北和華北挑選5個有代表性的種植區(qū)（北京市、河北省、河南省、吉林省和遼寧省）進(jìn)行種植，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，2次重復(fù)。成熟后每行選取長勢一致的5株植株用于單穗粒重測定。

1.3 基因組DNA的提取

將9份試驗(yàn)材料種子室溫萌發(fā)15 d左右，各取10株幼苗的幼嫩葉片混合磨樣，參照 ROGERS等[16]CTAB法提取玉米基因組DNA。檢測DNA純度濃度，以達(dá)到重測序標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 雜種優(yōu)勢和配合力分析

利用產(chǎn)量相關(guān)性狀單穗粒重的中親優(yōu)勢和超高親優(yōu)勢值評估4份黃改系的雜種優(yōu)勢。中親優(yōu)勢和超高親優(yōu)勢的計算方法[17]如下：

中親優(yōu)勢（mid-parent heterosis，%）=（F1-MP）/MP×100

超高親優(yōu)勢（over-high parent heterosis，%）=（F1-HP）/HP×100

其中，F(xiàn)1、MP和HP分別代表F1各性狀平均值、2個親本各性狀平均值和高值親本各性狀平均值。

一般配合力（general combining ability，GCA）和特殊配合力（special combining ability，SCA）的相對效應(yīng)計算方法[18]如下：

一般配合力：

代表P1中第i個親本的一般配合力相對效應(yīng)值，代表P中第j個親本的一般配合力相對效應(yīng)值，2代表親本i和親本j組合的特殊配合力相對效應(yīng)值。n1代表P1中親本個數(shù)，n2代表P2中親本個數(shù)，xij代表親本i和親本j組合的平均值，x代表總平均值。

1.5 全基因組重測序

利用雙末端2×150 bp測序方法對供試材料進(jìn)行基因組重測序。將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行檢測過濾，去除被污染和低質(zhì)量序列，對過濾后得到的clean reads進(jìn)行后續(xù)分析。使用 BWA（version: 0.6.1-r104）軟件[19-20]的默認(rèn)參數(shù)將clean reads比對到B73 RefGen_v3參考基因組上[21-22]。為了減少SNP和InDel錯誤的數(shù)量，進(jìn)一步過濾不匹配reads和非唯一reads，并通過GATK（version 20171018）中的IndelRealigener程序進(jìn)行矯正。SNP和InDel的calling使用GATK和Picard V1.119軟件[23]進(jìn)行計算。每個樣本 SNP和 InDel的 calling使用GATK中的HaplotypeCaller程序包獨(dú)立計算。使用GATK中的GenotypeGVCFs程序包進(jìn)行多個樣本的vcf文件合并。對所有樣品進(jìn)行進(jìn)一步過濾，變異calling使用的最小 phred值置信閾值為 60，mapping質(zhì)量高于 40，mapping質(zhì)量的秩和檢驗(yàn)閾值設(shè)置為-12.5，ReadPosRankSum 參數(shù)設(shè)置為-8，每個堿基的測序深度大于2。

1.6 主成分分析及系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建

基于獲得的高質(zhì)量 SNP和 InDel，使用 GCTA V1.26.0軟件[24]進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）。使用Treebest v1.9.2軟件[25]計算遺傳距離矩陣，并在遺傳距離基礎(chǔ)上利用鄰接法（neighbor-joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。引導(dǎo)值（bootstrap values）經(jīng)過1 000次計算獲得。

1.7 IBD片段分析

使用IBDseq[26]軟件對黃改系進(jìn)行IBD片段識別，檢測IBD片段的LOD值設(shè)為3，IBD片段端部邊緣的LOD值設(shè)為2.5，滑動窗口內(nèi)用于檢測的標(biāo)記數(shù)量設(shè)為4 000，最大等位基因錯誤率設(shè)為0.0001。當(dāng)京2416和兩選系親本之間都具有IBD片段時，以重組次數(shù)最少為原則，并且認(rèn)定具有較高P值的IBD片段作為最終結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 京2416與X群種質(zhì)的雜種優(yōu)勢分析

利用京2416、京24、5237和黃早四4份黃改系材料與 X群代表系京 724、京 464、DH382、京 725和京MC01的雜交組合F1一年五點(diǎn)的單穗粒重表型數(shù)據(jù)，計算中親優(yōu)勢和超高親優(yōu)勢（表2）。結(jié)果表明，黃改系和X系之間的雜種優(yōu)勢普遍存在，但不同雜交組合表現(xiàn)出的雜種優(yōu)勢程度存在一定差異。20個雜交組合的單穗粒重中親優(yōu)勢，為58.03%—113.93%，平均為85.72%，具有較高的中親優(yōu)勢。其中京2416和5個X群代表系的中親優(yōu)勢較為突出，均值為94.00%，明顯高于其2個選系親本和X系的雜交組合。20個雜交組合的單穗粒重超高親優(yōu)勢為27.65%—84.57%，平均為64.02%，其中，京2416和5個X群代表系的超高親優(yōu)勢均較高，均值為76.13%，整體水平高于其他3個黃改系和X系的雜交組合。

表2 4個黃改系和5個X系之間的雜交組合單穗粒重的雜種優(yōu)勢Table 2 Heterosis of F1 kernel weight per ear of combinations between 4 HILs and 5 X lines (%)

進(jìn)一步分析4個黃改系材料的配合力效應(yīng)值，表3為4個黃改系親本單穗粒重的一般配合力相對效應(yīng)值（relative effect of general combining ability，RGCA）和 20個雜交組合特殊配合力相對效應(yīng)值（relative effect of specific combining ability，RSCA）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4份黃改系的 RGCA為-6.75%—7.50%，20個雜交組合的RSCA為-6.54%—9.29%。黃改系中京2416的RGCA為7.50%，高于其2個選系親本京24和5237（2.68%和-3.68%），也高于黃早四（-6.75%）。說明京2416通過2個選系親本的基因組重組，較其選系親本和黃早四具有更高的配合力和雜種優(yōu)勢潛力。

2.2 全基因組變異檢測及遺傳結(jié)構(gòu)分析

為了從基因組層面解析京2416形成的遺傳機(jī)制，利用雙末端2×150 bp測序的方法對9份玉米自交系進(jìn)行了全基因組重測序（表4），其中4份黃改系數(shù)據(jù)來源于已發(fā)表文獻(xiàn)[13]，5份X群材料為新測數(shù)據(jù)。平均深度約為 18.32倍基因組，共產(chǎn)生約 348.52 Gb的高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)。平均基因組覆蓋度和比對率分別為90.14%和92.32%，共鑒定到31.6 M的SNP和InDel變異信息。

利用鑒定到的高質(zhì)量SNP和InDel對9份玉米自交系進(jìn)行主成分分析和系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建。通過主成分分析材料之間的親緣關(guān)系（圖1），黃改系和X系之間的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，在4份黃改系中京2416和京24的遺傳關(guān)系較近，5237與京24的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。通過系統(tǒng)發(fā)生樹分析9份材料的遺傳關(guān)系，結(jié)果和主成分分析結(jié)果保持一致。

表3 4個黃改系親本單穗粒重一般配合力相對效應(yīng)值和20個雜交組合特殊配合力相對效應(yīng)值Table 3 RGCA of 4 HILs parents’ kernel weight per ear and RSCA of 20 combinations

表4 9份玉米自交系的測序信息Table 4 Resequencing of 9 maize inbred lines

2.3 京2416形成過程中的重組事件

高通量測序?yàn)榻馕龉歉捎H本形成的遺傳基礎(chǔ)提供了豐富的數(shù)據(jù)信息。高密度SNP和InDel分子標(biāo)記的發(fā)掘和已知的系譜關(guān)系可以高分辨率地解析骨干自交系京2416形成的遺傳基礎(chǔ)。京2416的選育過程：首先將京24與5237雜交，再與京24回交1次，構(gòu)建基礎(chǔ)選系群體，按照高大嚴(yán)育種技術(shù)（高密度：大于90 000株/hm2；大群體：S1代群體精量點(diǎn)播出苗9 000株以上；嚴(yán)選擇：嚴(yán)格選擇標(biāo)準(zhǔn)，堅決淘汰生產(chǎn)中可能導(dǎo)致嚴(yán)重減產(chǎn)隱患的不良性狀），經(jīng)8代自交選育，創(chuàng)制出骨干自交系京2416（圖2-A）。利用高密度分子標(biāo)記分析發(fā)現(xiàn)，京2416和5237、京24之間的遺傳相似度分別為0.765和0.906；5237和京24之間的遺傳相似度為0.745，說明兩者差異較大；黃早四和京2416、京24、5237三者之間的遺傳相似度分別為 0.763、0.748和 0.796。IBD分析結(jié)果表明，京24和5237兩者共發(fā)生了32次重組事件最終形成了京2416（圖2-B）。其中第1、3、4、5和7染色體的重組次數(shù)較多，分別為6次、3次、6次、4次和10次重組；第6、9和10染色體重組次數(shù)較少，均為1次重組；第2和8染色體沒有重組。重組的數(shù)量和頻率與前人的研究結(jié)果類似[10]。京 24和 5237在京 2416基因組中保留的比例分別為 80.96%和 19.04%，兩者對于京2416的遺傳貢獻(xiàn)差異較大。

圖1 9份自交系的主成分分析（A）和系統(tǒng)發(fā)生樹（B）Fig. 1 PCA analysis (A)and phylogenetic tree (B) of 9 inbred lines

圖2 京2416及其2個選系親本的遺傳背景Fig. 2 The genetic background of Jing2416 and the two parents

2.4 黃早四到京2416基因組片段傳遞

京 2416保留了黃早四傳遞下來的很多優(yōu)勢性狀，例如抗病抗逆性強(qiáng)、適宜區(qū)域廣、早熟脫水快、自身產(chǎn)量及配合力高等，這些優(yōu)勢性狀通過黃早四的IBD基因組片段進(jìn)行傳遞。為了確定黃早四傳遞到京2416的IBD基因組片段，利用IBD方法對黃早四、京2416及其2個選系親本京24和5237的全基因組重測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在京24和5237中均存在一定數(shù)量的、連續(xù)的、大片段的IBD區(qū)段，并且重組位點(diǎn)基本沒有重合，暗示著兩者的育種選擇具有特異性（圖3）。黃早四基因組傳遞給京24和5237的比例分別為0.3849和0.5464，最終傳遞給京2416的比例為0.4236。比較黃早四傳遞給京24和5237的基因組片段，位置分布各具特點(diǎn)，根據(jù)LI等[13]黃改系馴化改良研究結(jié)果可知，黃改系中重要的 IBD傳遞區(qū)域和選擇消除區(qū)域在 2個京2416選系親本中被各自保留，而京2416從其親本黃改系中聚合了所有9個重要的IBD保守區(qū)域和選擇消除區(qū)域，例如5237的第4染色體和第5染色體區(qū)域，京24的第6染色體區(qū)域。說明京2416經(jīng)過京24和5237的染色體重組，聚合獲得了更多的黃改系重要基因組區(qū)域（圖3）。

圖3 京2416形成過程中重要基因組區(qū)段的傳遞Fig. 3 The important genomic segments transferred in the process of Jing2416 formation

3 討論

京2416是通過京24和5237 2個選系親本自交系的遺傳重組形成的。京24為北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心選育的黃改群骨干自交系，具有較強(qiáng)的抗倒伏能力和良好的早熟性。但一般配合力不高，產(chǎn)量潛力有限，感絲黑穗病和青枯病等主要病害。所組配的雜交種主要適宜京津冀早熟區(qū)域，在其他區(qū)域表現(xiàn)不突出。為了對京24進(jìn)行有針對性的改良，通過大量鑒定篩選出符合目標(biāo)需求的優(yōu)良自交系5237，5237有一定比例的旅系血緣，具有旅系的優(yōu)良性狀及較好的抗病性和抗逆性。以（京24×5237）×京24構(gòu)建基礎(chǔ)選系群體，通過“高大嚴(yán)”自交系選育方法[27-28]，創(chuàng)制出骨干自交系京 2416，具有配合力高、株型緊湊、抗倒伏、抗斑病、耐密等多個優(yōu)良性狀，且適應(yīng)性廣，綜合抗性好。該系目前已成為國家玉米良種攻關(guān)、七大農(nóng)作物育種、國家玉米產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系等多個重點(diǎn)項(xiàng)目及育種平臺研究應(yīng)用的骨干自交系，為今后中國玉米種質(zhì)的進(jìn)一步改良和利用提供了良好材料基礎(chǔ)。

本研究以產(chǎn)量相關(guān)性狀單穗粒重為例，對京2416等4份黃改系與5份X群種質(zhì)進(jìn)行雜種優(yōu)勢分析。其中京2416的中親優(yōu)勢（94.00%）明顯高于其他2個選系親本，但略低于黃早四（94.9%），這可能是由于黃早四作為黃改系的原始系，本身的單穗粒重值較小，但其具有高配合力特性，這也是其能夠衍生形成中國最重要雜種優(yōu)勢群的主要原因之一。玉米骨干自交系黃早四于20世紀(jì)70年代由北京市農(nóng)林科學(xué)院和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所共同選育，具有適應(yīng)性強(qiáng)、配合力高、株型緊湊、灌漿速度快等多方面優(yōu)良性狀[3-5]。黃早四衍生形成的黃改系保持了黃早四的優(yōu)良性狀和高配合力，LI等[13]對黃改系的研究結(jié)果表明，黃早四傳遞給其他黃改系的IBD片段中存在一些重要的基因組區(qū)域，這些區(qū)域在幾乎所有的黃改系基因組區(qū)域中均得到了保留，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，超過60%的選擇消除信號聚集在IBD保守區(qū)域。在育種過程中，人工選擇會使基因組產(chǎn)生大量的選擇區(qū)域，而這些選擇區(qū)域通常會富集稀有等位基因和優(yōu)異農(nóng)藝性狀基因[29-30]，對于黃改系的研究也證實(shí)黃改系的特征性選擇區(qū)域中富集了與產(chǎn)量相關(guān)的基因/QTL[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，京2416的IBD傳遞區(qū)域中包含了大量的黃改系IBD保守區(qū)域和選擇消除區(qū)域，并且這些IBD區(qū)域分別來自不同的選系親本，同時京2416從其選系親本中聚合了黃改系幾乎所有的重要特征性選擇區(qū)域，證明高大嚴(yán)及同群優(yōu)系聚合育種技術(shù)的有效性?；谏鲜鲞x擇區(qū)域，將進(jìn)一步挖掘功能位點(diǎn)，開發(fā)分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇育種，以期在黃改系的遺傳改良中發(fā)揮更大作用。

4 結(jié)論

與其他3份材料（黃改系京24、5237和黃早四）相比，骨干自交系京2416具有更高的超高親優(yōu)勢和一般配合力。京2416在選育過程中，由2個選系親本（京24和5237）中聚合了所有的9個重要黃改系特征性選擇區(qū)域，從分子水平解釋了京2416與X群代表系組配表現(xiàn)出更高配合力的遺傳基礎(chǔ)。