莊金寶，郭志鵬，孫婧婷，石 旭，曹 揚(yáng)*

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院二部 1.檢驗(yàn)科；2.呼吸科，吉林 長(zhǎng)春130032)

膜性腎病(MN)是由免疫介導(dǎo)性炎癥所致的腎損害，以腎小球損傷為主，是導(dǎo)致腎病綜合征的一個(gè)常見(jiàn)病因，發(fā)病率僅次于IgA腎病及系膜增生性腎小球腎炎[1,2]。根據(jù)有無(wú)繼發(fā)性原因，MN可分為繼發(fā)性和原發(fā)性膜性腎病(IMN)。繼發(fā)性MN患者存在明確的誘發(fā)因素，如病毒感染、用藥及腫瘤等原因引起，而IMN的發(fā)病機(jī)制目前被認(rèn)為是抗磷脂酶A2受體抗體識(shí)別并結(jié)合腎小球足細(xì)胞基底膜側(cè)的固有抗原，二者形成免疫復(fù)合物后沉積在腎小球毛細(xì)血管上皮處，導(dǎo)致毛細(xì)血管基底膜彌漫性增厚，損傷足細(xì)胞，破壞腎小球?yàn)V過(guò)屏障，產(chǎn)生蛋白尿[3,4]。

免疫復(fù)合物的形成是由B細(xì)胞分泌的抗體介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)，因此IMN的發(fā)生也被認(rèn)為與B細(xì)胞功能異常有關(guān)。濾泡輔助性T細(xì)胞(Tfh)是一類CD4+CXCR5+的T細(xì)胞亞群，表面標(biāo)記物有ICOS(CD278)、PD-1(CD279)、BCL-6、IL-21等，可在CXCL13的趨化下被募集到淋巴濾泡，通過(guò)與B細(xì)胞接觸和(或)分泌細(xì)胞因子IL-21來(lái)促使B細(xì)胞分化為抗原特異性的漿細(xì)胞或者記憶B細(xì)胞，并協(xié)助激活B細(xì)胞，促進(jìn)免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換，維持長(zhǎng)時(shí)間的體液免疫應(yīng)答，是輔助B細(xì)胞功能的主要T細(xì)胞亞群[5,6]。已有研究證明，在如IgG4 相關(guān)性疾病等B細(xì)胞功能異常疾病中均發(fā)現(xiàn)Tfh的異常[7,8]，但是不同Tfh亞群在不同分期IMN患者中的比例及其改變尚未完全明確。本文將在根據(jù)IMN患者24 h蛋白尿進(jìn)行分組，研究Tfh及其不同亞群在不同組別患者中的比例及它們與患者臨床指標(biāo)的相關(guān)性，為評(píng)估IMN疾病進(jìn)展提供新指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院腎病科2019年1月-2020年2月間確診的IMN患者39例，男性24例，女性15例；健康對(duì)照組(HC)18例，男性11例，女性7例。根據(jù)臨床上對(duì)IMN患者的危險(xiǎn)分級(jí)以及相應(yīng)的治療標(biāo)準(zhǔn)，以患者24 h尿蛋白定量為分組依據(jù)，將IMN患者分為A組(<4 g)、B組(4-8 g)和C組(>8 g)3組。志愿者均已排除患有糖尿病、腫瘤、病毒性肝炎或其他感染，以及近6個(gè)月內(nèi)服用過(guò)內(nèi)類固醇或細(xì)胞毒性藥物，并排除過(guò)敏性紫癜腎炎、狼瘡性腎炎、和原發(fā)性腎小球腎炎患者。IMN患者組以及健康對(duì)照組的具體臨床指標(biāo)見(jiàn)表1。

表1 IMN患者組及對(duì)照組臨床指標(biāo)參數(shù)

1.2 樣本采集與分析

分別抽取患者及對(duì)照組志愿者清晨空腹靜脈血5 ml，應(yīng)用拜耳ADVIA 1650全自動(dòng)生化分析系統(tǒng)檢測(cè)甘油三酯、膽固醇、尿蛋白定量和血尿酸，并在顯微鏡下觀察鏡下血尿。

1.3 方法

1.3.1外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離 取新鮮采集的肝素鈉抗凝的外周血，1 200 rpm/min離心去除血漿，將等體積淋巴細(xì)胞分離液置于15 ml離心管中，隨后吸取全血，沿離心管壁緩慢加至分離液上層，1 800 rpm離心30 min，用移液器將中間的白膜層(即單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞富集層)轉(zhuǎn)移至另一個(gè)新的離心管中，經(jīng)PBS洗滌2遍后用RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1.0×106/mL備用。

1.3.2外周血中Tfh細(xì)胞表型的流式鑒定 取分離的PBMC 100 μl加入流式管中，每個(gè)流式管中同時(shí)加入以下熒光標(biāo)記抗體：anti-CD4-APC、anti-CXCR5-PerCP、anti-CD278-PE，anti- CD279-FITC，同型對(duì)照管加入相應(yīng)的同型抗體，混勻后室溫避光孵育30 min，經(jīng)PBS洗滌2遍后棄上清，1%多聚甲醛固定，24 h內(nèi)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)，通過(guò)Flowjo軟件分析CD4+CXCR5+Tfh及其兩個(gè)亞群CD4+CXCR5+ICOS+Tfh、CD4+CXCR5+PD-1+Tfh在外周血中所占比例。

1.3.3IL-21+Tfh細(xì)胞比例的測(cè)定 將分離后的PBMC用RMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105/well，鋪于24孔板，加入50 ng/mL PMA和1.0 μg/mL伊諾霉素，置于37℃孵箱，刺激2 h后加入BFA，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，隨后收集細(xì)胞，加入PerCP-anti-CXCR5和APC-anti-CD4熒光抗體室溫孵育30 min，再加入固定破膜劑和Alexaflour 647-anti-IL-21熒光一抗，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌后應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CXCR5+IL-21+Tfh細(xì)胞的比例。

1.3.4ELISA方法測(cè)定血清中IL-21含量 根據(jù)IL-21 ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣品孔和空白對(duì)照孔。在標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入經(jīng)倍比稀釋的不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品100 μl，在待測(cè)樣本孔中加入經(jīng)樣本稀釋液(樣本稀釋5倍)稀釋好的待測(cè)樣本100 μl，置37℃孵箱溫育30 min，用洗滌液將孔板充分洗滌后加入酶標(biāo)一抗工作液100 μl，37℃溫育30 min，充分洗滌后每孔加入底物工作液100 μl，37℃避光顯色15 min后將100 μl終止液加至每孔，15 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)各孔吸光度(OD)值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，隨后根據(jù)樣本的OD值計(jì)算出其對(duì)應(yīng)的濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 IMN患者外周血循環(huán)Tfh細(xì)胞的比例分布特點(diǎn)

Tfh細(xì)胞表面標(biāo)志分子為CD4和CXCR5，除此外Tfh常見(jiàn)的表面標(biāo)志分子還有ICOS和PD-1。因此我們?cè)诓煌制贗MN患者外周血中進(jìn)行了總Tfh細(xì)胞(CD4+CXCR5+)及其兩個(gè)亞群：ICOS+Tfh(CD4+CXCR5+ICOS+)和PD-1+Tfh(CD4+CXCR5+PD-1+)細(xì)胞的比例分布研究。在分離患者外周血單個(gè)核細(xì)胞后，與帶不同熒光染料的anti-CD4、anti-CXCR5、anti-CD278(ICOS)和anti-CD279(PD-1)一抗共同孵育，隨后利用流式細(xì)胞儀分析，各Tfh亞群的劃分如圖1所示。分析后結(jié)果表明，與HC對(duì)照組相比，Tfh、ICOS+Tfh和PD-1+Tfh細(xì)胞比例在B組患者中明顯升高，但是在C組患者中這三者的比例均明顯下降，如圖2所示。

圖1 流式細(xì)胞儀分析各Tfh細(xì)胞亞群圈門示意圖

*P<0.05

2.2 ICOS+/PD-1+Tfh比值在不同IMN分組中的變化

盡管外周血中Tfh、ICOS+Tfh和PD-1+Tfh的比例在A組、B組患者中呈上升趨勢(shì)，在C組中明顯下降，但是我們發(fā)現(xiàn)，C組患者中ICOS+/PD-1+Tfh的比值卻明顯高于B組，而B(niǎo)組中該比值又高于A組(P<0.05)，如圖3所示。提示，ICOS+/PD-1+Tfh比值可能與IMN疾病進(jìn)展相關(guān)。

*P< 0.05

2.3 Tfh細(xì)胞內(nèi)外IL-21的表達(dá)水平

由于IL-21是Tfh細(xì)胞分泌的效應(yīng)因子，可參與調(diào)節(jié)B細(xì)胞分化與增殖[9,10]，因此我們對(duì)Tfh胞內(nèi)及胞外IL-21的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。如圖4所示，通過(guò)ELISA技術(shù)檢測(cè)胞外IL-21水平，我們發(fā)現(xiàn)IMN患者組的血清IL-21表達(dá)均高于HC組(P< 0.05)，但其在3個(gè)患者組之間的表達(dá)沒(méi)有明顯差異。IL-21+Tfh細(xì)胞在IMN患者組中的比例均高于HC組，其中C組中的比例又明顯高于A組和B組，但在A、B兩組之間沒(méi)有明顯差異，如圖5所示。

*P<0.05

*P<0.05

2.4 Tfh亞群比例與IMN臨床指標(biāo)的相關(guān)性

由于ICOS+/PD-1+Tfh比值和IL-21+Tfh在外周血中的比例在IMN患者中普遍升高，尤其在高危險(xiǎn)患者組中，二者均明顯上調(diào)，因此我們推測(cè)ICOS+/PD-1+Tfh比值和IL-21+Tfh比例可能與IMN疾病進(jìn)展相關(guān)。通過(guò)Spearman檢驗(yàn)分析二者與IMN患者24 h尿蛋白量之間的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)IMN患者24 h尿蛋白量與ICOS+/PD-1+Tfh比值之間呈正相關(guān)(r=0.8325,P<0.05)，而與IL-21+Tfh比例相關(guān)性不顯著(r=0.3825,P>0.05)，如圖6所示。

圖6 IMN患者24 h尿蛋白與ICOS+/PD-1+ Tfh比值的相關(guān)性

3 討論

IMN大多數(shù)發(fā)展相對(duì)緩慢，并且存在自發(fā)緩解與加重兩種趨勢(shì)，患者腎功能在輕中度時(shí)能維持正常，一旦進(jìn)行性發(fā)展將導(dǎo)致腎功能不全。因此，評(píng)估患者進(jìn)展至慢性腎功能不全的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)IMN患者進(jìn)行危險(xiǎn)分級(jí)再進(jìn)行治療是針對(duì)IMN的重要治療理念。作為一種由抗原抗體免疫復(fù)合物沉積引起的足細(xì)胞損傷性疾病，分泌抗體的B細(xì)胞異常激活是IMN發(fā)病及進(jìn)展的重要病因，而輔助型的Tfh細(xì)胞則在促進(jìn)生發(fā)中心形成以及輔助B細(xì)胞活化、增殖的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Kraaijeveld等[11]發(fā)現(xiàn)應(yīng)用鈣調(diào)磷酸酶抑制劑(他克莫司)抑制Tfh細(xì)胞后，B細(xì)胞分化也受到明顯抑制。Zhang等[12]發(fā)現(xiàn)在新發(fā)MN患者中，漿細(xì)胞升高的同時(shí)也伴隨Tfh細(xì)胞比例的上升。因此，我們需要進(jìn)一步明確Tfh細(xì)胞在IMN疾病進(jìn)展中的改變及其臨床意義。

Tfh是CD4+CXCR5+的T細(xì)胞亞群，其表面其他的標(biāo)志性分子如ICOS、PD-1等對(duì)Tfh的遷移、定位、分化、發(fā)育起著重要作用，Tfh表面標(biāo)志分子表達(dá)異常可以提示其功能的改變[5,6]。ICOS是CD28家族成員，屬于誘導(dǎo)性協(xié)同刺激分子，能夠和B細(xì)胞上的CD278配體結(jié)合傳遞刺激信號(hào)，對(duì)于促進(jìn)Tfh表達(dá)IL-21并協(xié)助記憶性B細(xì)胞的形成有重要作用，其被T細(xì)胞活化所誘導(dǎo)，因此也是T細(xì)胞激活的一個(gè)標(biāo)志[13]。IL-21由Tfh細(xì)胞產(chǎn)生，能夠誘導(dǎo)Tfh遷移、分化及表達(dá)ICOS，是Tfh存活及B細(xì)胞增殖分化過(guò)程中的關(guān)鍵因子[8-10]。PD-1也是CD28家族一員，但屬于免疫抑制性受體，其與配體PD-L1結(jié)合后傳遞抑制性信號(hào)，可抑制T淋巴細(xì)胞增殖及產(chǎn)生細(xì)胞因子，減弱ICOS和IL-21對(duì)Tfh細(xì)胞的活化[14,15]。另外，PD-1一方面抑制B細(xì)胞的增殖、分化和Ig類型轉(zhuǎn)換，但另一方面也能協(xié)助B細(xì)胞促進(jìn)生發(fā)中心的形成[16]，因此PD-1在Tfh中的表達(dá)具有多方面功能，我們猜測(cè)這可能與PD-1表達(dá)的水平和時(shí)間點(diǎn)有關(guān)。

因此，本研究根據(jù)臨床上對(duì)IMN患者危險(xiǎn)等級(jí)的劃分及治療方案的區(qū)別，以24 h蛋白尿?yàn)榉纸M標(biāo)準(zhǔn)，在不同疾病進(jìn)展階段的IMN患者中比較了Tfh細(xì)胞及ICOS+Tfh和PD-1+Tfh亞群在外周血中所占的比例及變化趨勢(shì)。我們發(fā)現(xiàn)，Tfh、ICOS+Tfh和PD-1+Tfh在低度(A組)和中度危險(xiǎn)(B組)患者中的比例呈上升趨勢(shì)，并均高于健康對(duì)照組HC，然而在高度(C組)危險(xiǎn)患者中這三者的比例卻均下降，我們推斷這可能與高度危險(xiǎn)患者本身機(jī)體免疫功能明顯下降有關(guān)。分泌至胞外的IL-21在IMN患者血清中含量均高于HC組，但患者組間并沒(méi)有明顯差異。IL-21+Tfh細(xì)胞比例在C組中的表達(dá)水平明顯高于A組、B組和HC組，因此盡管高度危險(xiǎn)患者體內(nèi)Tfh及其亞群比例下降，但其中表達(dá)IL-21的Tfh比例卻升高了，提示高度危險(xiǎn)患者體內(nèi)Tfh具有更好的促進(jìn)B細(xì)胞增殖和活化的能力。另外，我們還發(fā)現(xiàn)ICOS+Tfh和PD-1+Tfh兩者的比值隨IMN的危險(xiǎn)分級(jí)明顯上升，這提示我們ICOS+/PD-1+Tfh比值可能與IMN疾病進(jìn)展相關(guān)。隨后我們對(duì)ICOS+/PD-1+Tfh比值與IMN患者24 h尿蛋白量做了相關(guān)性分析，證明其與IMN疾病進(jìn)展相關(guān)。因此，定期在IMN患者中檢測(cè)ICOS+/PD-1+Tfh比值有可能作為預(yù)測(cè)或評(píng)估IMN疾病進(jìn)展的一個(gè)新指標(biāo)。