薛棟 舒孟良 張建 夏修良 陳雨信

(濱州市人民醫(yī)院 1普外一科，山東 濱州 256610；2重癥醫(yī)學(xué)科；3病理科；4山東大學(xué)齊魯醫(yī)院肝膽外科)

肝細(xì)胞癌(HCC)是消化系統(tǒng)較常見的腫瘤，我國(guó)是慢性乙型病毒性肝炎大國(guó)，慢性乙型病毒性肝炎-肝硬化-HCC是肝病患者的自然過程，HCC導(dǎo)致了嚴(yán)重的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，手術(shù)切除仍是早期HCC的最佳治療方案，中、晚期HCC主要采用以放化療、靶向、免疫聯(lián)合中藥為主的綜合治療。盡管針對(duì)HCC的藥物更新?lián)Q代，但5年生存率并沒有明顯提高，肝內(nèi)復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移是主要致死原因〔1〕。三結(jié)構(gòu)域蛋白(TRIM)家族在腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用〔2〕。TRIM59在許多惡性腫瘤中有高表達(dá)如結(jié)直腸癌、肺癌和骨肉瘤等，且與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)期生存率密切相關(guān)〔3～5〕。磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)是細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移等過程中的關(guān)鍵信號(hào)通路〔6〕。N-鈣黏蛋白(N-cadherin)是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的重要標(biāo)志分子〔7〕。但TRIM59和Akt、N-cadherin聯(lián)合評(píng)估與HCC的關(guān)系迄今文獻(xiàn)報(bào)道罕見。本研究通過免疫組化技術(shù)檢測(cè)HCC中TRIM59、Akt和N-cadherin的表達(dá)情況，探索HCC發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移過程中TRIM59、Akt和N-cadherin的作用，為探索針對(duì)TRIM59基因靶向治療HCC提供新的思路。

1 資料和方法

1.1臨床資料 收集2005年2月至2013年2月濱州市人民醫(yī)院98例HCC，60例癌旁肝組織，年齡30～80歲。所有患者術(shù)前未接受化療、分子靶向或免疫等治療。隨訪通過門診、電話和網(wǎng)絡(luò)等方式開展，中位隨訪時(shí)間50個(gè)月。

1.2試劑和方法 選取濱州市人民醫(yī)院病理科存檔的HCC組織蠟塊，高年資病理專業(yè)醫(yī)師重新進(jìn)行切片診斷。采用免疫組化(EnVision)法檢測(cè)TRIM59、Akt及N-cadherin蛋白表達(dá)。兔抗人TRIM59單抗、兔抗人Akt多抗和兔抗人N-cadherin多抗采購(gòu)于Santa Cruz公司，工作濃度為1∶200。EnVision試劑盒來源于Dako公司。已知陽性切片作為陽性對(duì)照，陰性對(duì)照用磷酸鹽緩沖液(PBS)。

1.3結(jié)果的判定 陽性染色是細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了黃色的細(xì)小顆粒。TRIM59、Akt蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，N-cadherin定位于細(xì)胞膜和或細(xì)胞質(zhì)。先判定染色的強(qiáng)度：0，1，2，3分，分別對(duì)應(yīng)無色、淡黃、棕黃、棕褐色。然后計(jì)算統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù):1、2、3、4分，分別對(duì)應(yīng)<5%、≥5%且<25%、≥25%且<50%、≥50%且<75%和≥75%。最終取前兩者的乘積，≥4分為免疫反應(yīng)陽性，<4分為免疫反應(yīng)陰性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件行χ2檢驗(yàn)、Spearman相關(guān)性分析、Kaplan-Meier法。

2 結(jié) 果

2.1HCC和癌旁肝組織中TRIM59、Akt和N-cadherin蛋白的表達(dá) 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃或棕褐色為TRIM59、Akt，細(xì)胞膜出現(xiàn)黃染為N-cadherin，見圖1。TRIM59在HCC組織中陽性率〔73.5%(72/98)〕明顯高于癌旁肝組織〔11.7%(7/60)〕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=56.859,P=0.000)。HCC組織中Akt的陽性率〔65.3%(64/98)〕明顯高于癌旁肝組織〔13.3%(8/60)〕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=40.528,P=0.000)。HCC組織中N-cadherin的陽性率〔57.1%(56/98)〕明顯高于癌旁肝組織〔16.7%(10/60)〕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=25.067,P=0.000)。

2.2TRIM59、Akt及N-cadherin陽性表達(dá)與HCC患者臨床病理參數(shù)間的關(guān)系 TRIM59、Akt及N-cadherin蛋白的表達(dá)與患者年齡、性別、甲胎蛋白(AFP)、腫瘤的大小無明顯相關(guān)(P>0.05)。TRIM59、Akt及N-cadherin伴隨腫瘤組織分化較差、血管伴有侵襲、TNM分期進(jìn)展而表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，見表1。

2.3TRIM59、Akt和N-cadherin在HCC中表達(dá)的關(guān)系 Spearman等級(jí)檢驗(yàn)結(jié)果表明，HCC中TRIM59與Akt表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.427，P=0.031)，TRIM59與N-cadherin表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.391，P=0.041)；Akt與N-cadherin表達(dá)也呈正相關(guān)(r=0.515，P=0.028)。

2.4生存分析 TRIM59陽性患者與陰性患者的3年總生存期(OS)分別為38%、77%，5年OS分別為21%、55%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。Akt陽性患者與陰性患者的3年OS分別為67%、54%，5年OS分別為48%及40%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。N-cadherin陽性HCC組患者和陰性HCC組患者3年OS分別為60%、54%，年OS分別為44%和39%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 TRIM59、Akt及N-cadherin蛋白的表達(dá)與肝癌臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

圖2 HCC 患者TRIM59陽性表達(dá)和生存時(shí)間的關(guān)系

3 討 論

TRIM家族其他成員如TRIM28、TRIM31等也參與惡性腫瘤增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等〔8,9〕。目前，TRIM59與HCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系文獻(xiàn)報(bào)道較少。有文獻(xiàn)報(bào)道胃癌中TRIM59高表達(dá)，且與TNM分期、預(yù)后有關(guān)，TRIM59還能降低p53表達(dá)調(diào)控胃癌侵襲轉(zhuǎn)移等〔10〕。膽管癌中TRIM59高表達(dá)，干擾膽管癌細(xì)胞TRIM59后，腫瘤細(xì)胞增殖及遷移力明顯下降〔11〕。本研究表明TRIM59與HCC發(fā)生發(fā)展密切有關(guān)。TRIM59蛋白還與病理學(xué)分級(jí)、腫瘤的分化程度、血管侵犯和TNM分期有關(guān)。TRIM59還是一個(gè)影響HCC預(yù)后因子。以上研究表明TRIM59對(duì)HCC臨床診療及預(yù)后判斷有一定意義。因此，我們推測(cè)TRIM59可能成為HCC治療的靶標(biāo)。

PI3K與Akt結(jié)合后快速轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)〔12〕。LY294002(Akt的阻斷劑)明顯抑制惡性腫瘤細(xì)胞過度增殖等〔13〕。本研究發(fā)現(xiàn)Akt在HCC中高表達(dá)；Akt升高伴隨著HCC病理學(xué)分級(jí)增加、分化差、血管侵襲明顯和臨床分期更晚，提示Akt參與了HCC惡性侵襲及轉(zhuǎn)移。HCC中的TRIM59與Akt呈正相關(guān)，提示TRIM59和Akt一起參與HCC增殖、侵襲轉(zhuǎn)移，推斷TRIM59可能通過一些分子機(jī)制激活PI3K/Akt通路促進(jìn)HCC侵襲轉(zhuǎn)移。

實(shí)體惡性腫瘤在侵襲轉(zhuǎn)移過程中經(jīng)常發(fā)生著上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)現(xiàn)象〔14〕?？谇击[癌中N-cadherin高表達(dá)，且高表達(dá)與腫瘤分化程度、TNM分期密切相關(guān)〔15〕。本研究發(fā)現(xiàn)N-cadherin在HCC中的表達(dá)率明顯高于癌旁肝組織。N-cadherin與病理學(xué)分級(jí)、腫瘤的分化程度、血管侵犯和臨床TNM分期具有相關(guān)性。TRIM59與Akt、N-cadherin均存在呈正相關(guān)，提示HCC中TRIM59、Akt和N-cadherin三者可能協(xié)同合作可能性大。