鐘慶 趙偉 汪輝德 楊岸 翁艷 羅志剛 黃光平 楊國仁

(1簡陽市人民醫(yī)院麻醉疼痛科，四川 簡陽 641400;2南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院麻醉科；簡陽市人民醫(yī)院 3中心實(shí)驗(yàn)室；4骨科)

瑞芬太尼作為一種麻醉藥，其在乳腺癌、胃癌、肺癌、肝癌、直腸癌、宮頸癌中均具有一定的治療作用〔1～3〕，但是其在骨肉瘤中的作用及機(jī)制知之甚少。96序列相似的家庭成員B(FAM96B，MIP18，CGI-128)位于16q22.1-q22.3，含有163個(gè)氨基酸，分子量為18 kD〔4，5〕。目前國內(nèi)外關(guān)于FAM96B在癌癥中的研究甚少，其在骨肉瘤中的作用尚未有人報(bào)道。本研究擬以骨肉瘤細(xì)胞SAOS-2為研究對象，觀察瑞芬太尼及FAM96B對骨肉瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響，探討瑞芬太尼發(fā)揮作用的機(jī)制與調(diào)控FAM96B的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料 人骨肉瘤細(xì)胞SAOS-2購自ATCC；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、噻唑藍(lán)(MTT)、胰蛋白酶均購自美國GIBCO公司；LipofectamineTM2000、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連Takara公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自德國羅氏診斷有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)液和放射免疫沉淀測定(RIPA)蛋白裂解液均購自碧云天生物技術(shù)公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將人骨肉瘤細(xì)胞SAOS-2用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至融合度75%左右，用胰蛋白酶消化約1 min，按照1∶3的比例更換培養(yǎng)基，每2 d傳代一次。

1.2.2細(xì)胞分組 將瑞芬太尼(0.0、0.5、5.0、50.0、500.0 ng/ml)與SAOS-2共培養(yǎng)24、48、72 h，用MTT法檢測其對SAOS-2的抑制率，選擇最適濃度(50.0 ng/ml)和時(shí)間(48 h)。將瑞芬太尼50.0 ng/ml處理48 h的SAOS-2標(biāo)記為瑞芬太尼組；si-NC是作陰性對照，正常的SAOS-2標(biāo)記為(Con)組。為了研究FAM96B對正常的SAOS-2和瑞芬太尼處理的SAOS-2的增殖、凋亡影響，將pcDNA、pcDNA-FAM96B、瑞芬太尼+si-NC、瑞芬太尼+si-FAM96B用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至SAOS-2，然后部分組用瑞芬太尼50.0 ng/ml處理48 h，分別標(biāo)記為pcDNA組、pcDNA-FAM96B組、瑞芬太尼+si-NC組、瑞芬太尼+si-FAM96B組，qRT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染成功后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 取適量對數(shù)生長期1.2.2各組細(xì)胞，遵照RNA抽提試劑盒說明書要求操作提取RNA，進(jìn)行定量，然后按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說明書操作合成cDNA。最后按qRT-PCR試劑盒說明書操作進(jìn)行FAM96B、Bcl-2、Bax 的mRNA檢測。用2-△△Ct計(jì)算FAM96B、Bcl-2、Bax的表達(dá)。

1.2.4Western印跡實(shí)驗(yàn) 收集1.2.2各組細(xì)胞，加入裂解液，冰上裂解30 min。12 000 r/min離心10 min。取上清置于EP管，加入SDS上樣緩沖液，沸水煮沸10 min。電泳后用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉將膜封閉2 h，洗膜，加入Ⅰ抗，4℃過夜孵育，洗膜，加Ⅱ抗，4℃ 2 h。加發(fā)光液，曝光。

1.2.5MTT實(shí)驗(yàn) 取適量1.2.2各組細(xì)胞，加入20 μl 5 g/L的MTT溶液，培養(yǎng)4 h，然后棄去上清，每孔加入150 μl DMSO，震蕩，使結(jié)晶溶解，在490 nm波長下檢測細(xì)胞吸光度(A)。細(xì)胞抑制率=〔1-A490樣品/ A490對照〕×100%。

1.2.6膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC/PI)流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn) 將1.2.2各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，用 500 μl 的結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，分別加入5 μl的 Annexin V-/FITC避光反應(yīng)20 min后再加入5 μl的PI避光反應(yīng)20 min，用300目銅篩過濾，最后在1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀結(jié)束檢測。細(xì)胞的凋亡率(%)= 早期凋亡率+晚期凋亡率。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行方差分析，t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度瑞芬太尼不同時(shí)間抑制率比較 與24、72 h相比，處理48 h的SAOS-2的抑制率最合適。與0.0 ng/ml組相比，0.5、5.0、50.0、500.0 ng/ml組SAOS-2的抑制率均顯著升高，且呈顯著的濃度依賴性。故選用作用時(shí)間48 h，抑制率為50%左右的濃度(50 ng/ml)用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見表1。

表1 不同濃度瑞芬太尼不同時(shí)間抑制率比較

2.2瑞芬太尼對骨肉瘤SAOS-2凋亡的影響 與Con組〔(8.13±0.84)%〕相比，瑞芬太尼組SAOS-2的凋亡率顯著升高〔(23.56±1.98)%，P<0.05〕。見圖1。

圖1 細(xì)胞凋亡流式圖

2.3瑞芬太尼對骨肉瘤SAOS-2凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響 與Con組相比，瑞芬太尼組SAOS-2中Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低，Bax mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高(均P<0.001)。見表2，圖2。

表2 瑞芬太尼對骨肉瘤SAOS-2細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖2 瑞芬太尼對骨肉瘤SAOS-2細(xì)胞中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響

2.4瑞芬太尼對骨肉瘤SAOS-2中FAM96B表達(dá)的影響 與Con組相比，瑞芬太尼組SAOS-2中FAM96B mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高(均P<0.001)。見表3，圖3。

表3 瑞芬太尼對骨肉瘤SAOS-2細(xì)胞中FAM96B表達(dá)的影響

圖3 Western印跡檢測瑞芬太尼對骨肉瘤SAOS-2細(xì)胞中FAM96B蛋白表達(dá)的影響

2.5FAM96B過表達(dá)對骨肉瘤SAOS-2增殖和凋亡的影響 與pcDNA組相比，pcDNA-FAM96B組SAOS-2中FAM96B蛋白表達(dá)顯著升高，抑制率、凋亡率均顯著升高，Bcl-2蛋白顯著降低、Bax蛋白顯著升高(均P<0.001)。見圖4，表4。

圖4 FAM96B過表達(dá)后FAM968及凋亡相關(guān)蛋白的影響

表4 FAM96B過表達(dá)對骨肉瘤SAOS-2細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.6抑制FAM96B表達(dá)逆轉(zhuǎn)了瑞芬太尼對骨肉瘤SAOS-2細(xì)胞增殖和凋亡的作用 與Con組相比，瑞芬太尼組SAOS-2細(xì)胞中FAM96B蛋白表達(dá)顯著升高，抑制率、凋亡率均顯著升高，Bcl-2蛋白顯著降低、Bax蛋白顯著升高；與瑞芬太尼+si-NC組相比，瑞芬太尼+si-FAM96B組SAOS-2細(xì)胞中FAM96B蛋白表達(dá)顯著降低，抑制率、凋亡率均顯著降低，Bcl-2蛋白顯著升高、Bax蛋白顯著降低(P<0.001)。見表5，圖5。

表5 抑制FAM96B表達(dá)逆轉(zhuǎn)了瑞芬太尼對骨肉瘤SAOS-2細(xì)胞增殖和凋亡的作用

1～4：Con組、瑞芬太尼組、瑞芬太尼+si-NC組、瑞芬太尼+si-FAM96B組圖5 抑制FAM96B表達(dá)逆轉(zhuǎn)了瑞芬太尼對骨肉瘤SAOS-2細(xì)胞中FAM96B和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的作用

3 討 論

瑞芬太尼是一種超短效的麻醉性鎮(zhèn)痛藥，主要用于全身麻醉的誘導(dǎo)和維持鎮(zhèn)痛，其最常用的方法是通過微量注射泵持續(xù)的泵入靜脈給藥。據(jù)報(bào)道，阿片類藥物瑞芬太尼具有抗癌作用〔6〕，其在胰腺癌中具有通過失活蛋白激酶B(AKT)通路抑制癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡的功能〔7〕。Yoon等〔8〕研究中發(fā)現(xiàn)，瑞芬太尼可通過失活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)抑制破骨細(xì)胞的分化和成熟，并減少骨吸收。Solari等〔9〕研究中報(bào)道，瑞芬太尼有益于骨肉瘤患者的預(yù)后。本研究結(jié)果說明瑞芬太尼具有明顯的抗骨肉瘤功能；瑞芬太尼促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制與調(diào)控Bcl-2、Bax的表達(dá)相關(guān)，也為瑞芬太尼在骨肉瘤手術(shù)中的應(yīng)用提供充分的理論依據(jù)。本文Western印跡檢測發(fā)現(xiàn)，瑞芬太尼可上調(diào)FAM96B的表達(dá)。

FAM96B是一種高度保守的蛋白，其可通過堿性螺旋-環(huán)-螺旋蛋白E2-2、核苷酸切除修復(fù)蛋白同源物(MMS19)、腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位蛋白(ANT)2，細(xì)胞溶質(zhì)鐵硫蛋白組裝(Ciao)1及細(xì)胞的有絲分裂過程〔10～13〕。馬丹丹〔14〕研究報(bào)道，F(xiàn)AM96B在肺癌、肝癌的組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平均顯著升高，過表達(dá)FAM96能夠抑制肺癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，得到FAM96B也許在癌癥中發(fā)揮癌基因的功能。葉家欣等〔15〕、蔡遜等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM96B在胃癌、結(jié)直腸癌組織中表達(dá)顯著降低，過度表達(dá)FAM96B可抑制癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡。本研究結(jié)果說明瑞芬太尼上調(diào)FAM96B在骨肉瘤中發(fā)揮調(diào)控作用。進(jìn)一步研究說明上調(diào)FAM96B具有與瑞芬太尼相同的抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡的作用，更充分的說明瑞芬太尼上調(diào)FAM96B發(fā)揮抗骨肉瘤的功能。深入研究說明不僅瑞芬太尼具有上調(diào)FAM96B發(fā)揮抗骨肉瘤的功能，相反，F(xiàn)AM96B也具有逆向調(diào)控瑞芬太尼的抗癌功能。

綜上所述，瑞芬太尼可抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，其作用機(jī)制與上調(diào)FAM96B有關(guān)，為瑞芬太尼臨床用于骨肉瘤手術(shù)麻醉提供新的支持。