謝靜 郭振凱

(1新鄉(xiāng)醫(yī)學院三全學院臨床學院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院消化內(nèi)科)

肝癌是發(fā)病率與死亡率極高的惡性腫瘤，其主要特點為惡性程度高、術(shù)后易復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移等，同時關(guān)于肝癌細胞增殖、遷移、侵襲的機制尚未完全闡明〔1〕。深入探究肝癌細胞惡性生物學行為發(fā)生機制對提高臨床治療效果及改善患者預(yù)后均具有重要意義。長鏈非編碼RNAs(LnRNAs)在乳腺癌等多種惡性腫瘤中均異常表達，并可促進腫瘤發(fā)生及發(fā)展〔2〕。研究表明LnRNA FOXD2-AS1在多種惡性腫瘤中均呈高表達，并可促進腫瘤進展過程〔3〕。LncRNA FOXD2-AS1調(diào)節(jié)軟骨細胞增殖，還可影響甲狀腺癌及膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展〔4～6〕。然而LncRNA FOXD2-AS1在肝癌中的表達和作用還未可知。通過生物信息學網(wǎng)站預(yù)測LncRNA FOXD2-AS1的 3′UTR存在微小RNA-122-5p(miR-122-5p)連續(xù)性結(jié)合位點，研究表明miR-122在肝癌細胞中呈低表達，上調(diào)miR-122表達可增強肝癌細胞放射敏感性，同時血清miR-122表達水平還可作為評估肝癌患者預(yù)后的重要標志物〔7，8〕。FOXD2-AS1是否通過調(diào)控miR-122-5p抑制肝癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移，還有待證明。本研究旨在通過檢測肝癌細胞中FOXD2-AS1與miR-122-5p表達，通過下調(diào)肝癌SMMC-7721細胞中FOXD2-AS1表達及上調(diào)miR-122-5p表達，探究FOXD2-AS1是否通過靶向調(diào)控miR-122-5p表達影響肝癌細胞增殖、遷移及侵襲，為臨床肝癌分子靶向治療提供潛在靶點。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 肝癌細胞株SMMC-7721、HepG2、BEL-7402與正常肝細胞HL-7702均購自中國科學院上海細胞庫。FoxD2-AS1 siRNA、miR-122-5p mimic、miR-122-5p抑制劑(anti-miR-122-5p)及LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒均購自美國Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；Mgteigel基質(zhì)膠購自上海然泰生物科技有限公司；雙熒光素酶報告基因試劑盒購自美國Promega公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)定量試劑盒均購自美國ThermoFisher公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑盒、聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)試劑盒均購自上海碧云天生物科技有限公司；Transwell小室購自上海玉博生物科技有限公司；兔抗人G1/S-特異性周期蛋白(Cyclin)-D1、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9、MMP-2單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗購自英國Abcam公司。

1.2細胞轉(zhuǎn)染及分組 用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)SMMC-7721、HepG2、BEL-7402、HL-7702細胞，隔天更換培養(yǎng)液，當細胞匯合率達80%進行傳代培養(yǎng)。將SMMC-7721細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板，置于溫度為37℃、CO2體積分數(shù)5%的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后進行轉(zhuǎn)染，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒說明書分別或同時轉(zhuǎn)染si-con、si-FOXD2-AS1、anti-miR-con、anti-miR-122-5p、miR-con、miR-122-5p mimic，轉(zhuǎn)染6 h后更換為DMEM完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.3qRT-PCR檢測FOXD2-AS1、miR-122-5p表達 采用Trizol法提取細胞總RNA，取適量1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)SYBR Green PCR Master Mix試劑盒說明書配置qRT-PCR體系，反應(yīng)條件為95℃ 2 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40次循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算FOXD2-AS1、miR-122-5p相對表達量。

1.4雙熒光素酶報告基因檢測 通過生物信息學網(wǎng)站預(yù)測FOXD2-AS1與miR-122-5p存在結(jié)合位點，用PCR擴增FOXD2-AS1中含有miR-122-5p結(jié)合位點片段，并將其插入熒光素酶報告基因載體，用FOXD2-AS1野生型質(zhì)粒(WT-FOXD2-AS1)與突變型質(zhì)粒(MUT-FOXD2-AS1)分別或同時轉(zhuǎn)染SMMC-7721細胞，根據(jù)雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測細胞相對熒光素酶活性。

1.5MTT檢測細胞增殖 收集轉(zhuǎn)染后各組對數(shù)生長期SMMC-7721細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每組均設(shè)置3個復(fù)孔，轉(zhuǎn)染后24、48、72 h每孔加入20 μl MTT溶液，放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，分別加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl/孔，混勻，應(yīng)用酶標儀檢測各孔在波長為490 nm處的吸光度(OD)值，OD值大小表示細胞增殖活性高低。

1.6Transwell實驗檢測細胞遷移及侵襲 細胞遷移實驗：收集各組轉(zhuǎn)染后SMMC-7721細胞，胰蛋白酶消化，2 000 r/min離心5 min，收集細胞沉淀并加入400 μl無血清DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，調(diào)整細胞密度為1×105/ml，取細胞懸液200 μl置于Transwell小室的上室，取含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液500 μl置于Transwell小室的下室，完成后放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，7 h后除去Transwell小室的上室表面細胞，晾干后用結(jié)晶紫染色，30 min后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，置于顯微鏡下隨機選取5個視野觀察計算遷移細胞數(shù)。細胞侵襲實驗：預(yù)先將50 μl Matrigel基質(zhì)膠與不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)液稀釋(稀釋比1∶8)，稀釋后鋪于Transwell小室(孔徑8 μm)基底膜的上表面，其余實驗步驟同細胞遷移實驗，結(jié)晶紫染色30 min后用PBS洗滌，顯微鏡下隨機選取5個視野觀察并計算侵襲細胞數(shù)。

1.7Western印跡檢測Cyclin-D1、MMP-2、MMP-9蛋白表達 收集各組SMMC-7721細胞，預(yù)先預(yù)冷PBS洗滌，加入蛋白裂解液提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，蛋白上樣量為20 μg/孔，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，脫脂奶粉封閉1 h，4℃下結(jié)合Cyclin-D1、MMP-2、MMP-9一抗(1∶400)過夜，室溫下結(jié)合二抗(1∶1 000)2 h，TBST洗滌3次，10 min/次，ECL顯色并應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)分析各條帶灰度值，計算目的蛋白條帶與β-actin蛋白條帶灰度值的比值。

1.8統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1肝癌細胞株中FoxD2-AS1和miR-122-5p的表達 與正常肝細胞HL-7702比較，肝癌細胞系SMMC-7721、HepG2、BEL-7402中FoxD2-AS1水平明顯升高(P<0.05)，miR-122-5p水平明顯降低(P<0.05)，以SMMC-7721細胞變化最為顯著，因此本研究選取SMMC-7721細胞進行后續(xù)實驗。見表1

2.2FOXD2-AS1靶向調(diào)控miR-122-5p的表達 由圖1可知，F(xiàn)OXD2-AS1基因序列上存在miR-122-5p結(jié)合位點，雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示miR-122-5p過表達可顯著減弱WT-FOXD2-AS1的熒光素酶活性(P<0.05)，而結(jié)合位點突變后miR-122-5p過表達后MUT-FOXD2-AS1片段熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)，見表2。qRT-PCR實驗結(jié)果顯示，si-FOXD2-AS1組miR-122-5p水平(4.76±0.48)顯著高于si-con組(0.99±0.10，P<0.05)；pcDNA-FOXD2-AS1組(0.32±0.03)顯著低于pcDNA組(0.98±0.09，P<0.05)。

表1 肝癌細胞株中FoxD2-AS1和miR-122-5p的表達

圖1 FOXD2-AS1與miR-122-5p互補的核苷酸序列

表2 雙熒光素酶報告實驗

2.3干擾FOXD2-AS1表達對肝癌細胞SMMC-7721增殖、遷移、侵襲的影響 qRT-PCR實驗結(jié)果顯示，干擾FOXD2-AS1表達后SMMC-7721細胞FOXD2-AS1水平顯著降低(P<0.05)，提示成功抑制FOXD2-AS1表達。MTT實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后48、72 h與si-con組比較，si-FOXD2-AS1組SMMC-7721細胞增殖活性明顯降低(P<0.05)。Transwell遷移及侵襲實驗結(jié)果顯示，si-FOXD2-AS1組SMMC-7721細胞遷移及侵襲數(shù)目均明顯低于si-con組(P<0.05)，見圖2、表3。

圖2 檢測肝癌細胞SMMC-7721遷移和侵襲(×200)

表3 下調(diào)FOXD2-AS1表達對肝癌細胞SMMC-7721增殖、遷移、侵襲的影響

2.4過表達miR-122-5p對肝癌細胞SMMC-7721增殖、遷移、侵襲的影響 qRT-PCR實驗結(jié)果顯示，miR-122-5p組SMMC-7721細胞miR-122-5p表達水平明顯升高(P<0.05)，提示轉(zhuǎn)染成功。MTT實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后48、72 h與miR-con組相比，miR-122-5p組SMMC-7721細胞OD值顯著降低(P<0.05)。Transwell遷移及侵襲實驗結(jié)果顯示，miR-122-5p組SMMC-7721細胞遷移及侵襲數(shù)較miR-con組明顯減少(P<0.05)，見表4。

2.5沉默F(xiàn)OXD2-AS1表達和干擾miR-122-5p表達對肝癌細胞SMMC-7721增殖、遷移、侵襲的作用 qRT-PCR實驗結(jié)果顯示，抑制FOXD2-AS1與miR-122-5p表達后SMMC-7721細胞miR-122-5p表達水平顯著降低(P<0.05)。轉(zhuǎn)染后48、72 h與si-FOXD2-AS1+anti-miR-con組比較，si-FOXD2-AS1+ anti-miR-122-5p組細胞OD值明顯增加(P<0.05)，細胞遷移及侵襲數(shù)均明顯增多(P<0.05)，見表5。

表4 上調(diào)miR-122-5p表達對肝癌細胞SMMC-7721增殖、遷移、侵襲的影響

表5 干擾miR-122-5p表達逆轉(zhuǎn)沉默F(xiàn)OXD2-AS1表達對肝癌細胞SMMC-7721增殖、遷移、侵襲的抑制作用

2.6沉默F(xiàn)OXD2-AS1表達和干擾miR-122-5p表達對肝癌細胞SMMC-7721增殖蛋白和轉(zhuǎn)移蛋白表達的影響 沉默F(xiàn)OXD2-AS1表達能顯著抑制肝癌細胞增殖相關(guān)蛋白Cyclin-D1的表達(P<0.05)，抑制miR-122-5p表達可明顯促進Cyclin-D1表達并可顯著減弱沉默F(xiàn)OXD2-AS1表達對Cyclin-D1表達的抑制作用(P<0.05)。與si-con組比較，si-FOXD2-AS1組MMP-2與MMP-9蛋白表達顯著降低(P<0.05)，與si-FOXD2-AS1+anti-miR-con組比較，si-FOXD2-AS1+ anti-miR-122-5p組MMP-2與MMP-9水平明顯升高(P<0.05)，見圖3、表6。

1～4:si-con組、si-FOXD2-AS1組、si-FOXD2-AS1+anti-miR-con組、si-FOXD2-AS1+anti-miR-122-5p組圖3 細胞增殖蛋白和轉(zhuǎn)移蛋白表達

表6 沉默F(xiàn)OXD2-AS1表達和干擾miR-122-5p表達對肝癌細胞SMMC-7721增殖蛋白和轉(zhuǎn)移蛋白表達的影響

3 討 論

肝癌發(fā)病過程十分復(fù)雜且已嚴重威脅人類生命安全，研究發(fā)現(xiàn)LncRNAs表達異常與肝癌發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)〔9〕。相關(guān)研究表明LncRNA HOXD-AS1可通過調(diào)控SOX4表達進而促進肝癌細胞增殖及遷移〔10〕。由此可知LncRNA在肝癌發(fā)生及發(fā)展過程中扮演重要角色。FOXD2-AS1在膀胱癌中上調(diào)表達并可促進癌細胞增殖及遷移〔11〕。食管癌中FOXD2-AS1表達水平升高并與患者預(yù)后不良密切相關(guān)，并可能作為評估患者預(yù)后的重要指標〔12〕。結(jié)直腸癌細胞中FOXD2-AS1呈高表達并可發(fā)揮癌基因作用促進癌細胞遷移〔13〕。張清等〔14〕研究表明FOXD2-AS1在卵巢癌組織及細胞中均呈高表達，沉默F(xiàn)OXD2-AS1表達可通過調(diào)控miR-150-5p表達進而抑制卵巢癌細胞增殖及遷移。相關(guān)研究表明FOXD2-AS1可在膠質(zhì)瘤及黑色素瘤細胞中呈高表達并可促進細胞增殖、遷移及侵襲〔15，16〕。然而，F(xiàn)OXD2-AS1在肝癌細胞中的研究相對較少，本研究結(jié)果提示FOXD2-AS1可能在肝癌發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮癌基因作用；另外提示FOXD2-AS1可能通過促進肝癌細胞增殖、遷移及侵襲進而促進肝癌發(fā)生及發(fā)展。

通過RNA測序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)miR-122-5p在肝細胞癌中呈低表達，但關(guān)于其具體作用機制尚不清楚〔17〕。Maruyama等〔18〕研究表明miR-122-5p在胃癌組織中呈低表達并可作為臨床診斷的新型分子標志物。Xu等〔19〕研究表明miR-122-5p可通過靶向調(diào)節(jié)醛縮酶(ALDOA)表達進而抑制膽管癌細胞增殖、遷移及侵襲。本研究結(jié)果提示miR-122-5p可能在肝癌發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌基因作用。為了探究miR-122-5p對肝癌細胞的生物學行為的影響，本研究結(jié)果提示miR-122-5p可抑制肝癌細胞增殖、遷移及侵襲。LncRNA可通過競爭性吸附miRNA促使其表達下調(diào)進而發(fā)揮作用〔20〕。應(yīng)用生物信息學網(wǎng)站預(yù)測顯示FOXD2-AS1可互補結(jié)合miR-122-5p，雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示FOXD2-AS1可靶向調(diào)控miR-122-5p表達。提示FOXD2-AS1可通過調(diào)控miR-122-5p表達進而影響肝癌發(fā)展過程。同時本研究進一步研究FOXD2-AS1對肝癌細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響及其與miR-122-5p表達的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默F(xiàn)OXD2-AS1表達后再抑制miR-122-5p表達可提高肝癌細胞增殖活性并促進Cyclin-D1表達，腫瘤細胞異常增殖是導致腫瘤發(fā)生的主要原因，Cyclin-D1蛋白與細胞增殖有關(guān)，其表達水平異常升高可促進細胞增殖，下調(diào)Cyclin-D1表達可抑制細胞增殖〔21〕。本文結(jié)果提示沉默F(xiàn)OXD2-AS1可通過靶向調(diào)控miR-122-5p表達并下調(diào)Cyclin-D1表達進而抑制肝癌細胞增殖。腫瘤細胞遷移及侵襲是惡性腫瘤發(fā)展的主要原因〔22〕。本研究結(jié)果顯示沉默F(xiàn)OXD2-AS1表達可顯著減少肝癌細胞遷移及侵襲數(shù)目并降低MMP-2、MMP-9表達，再加入anti-miR-122-5p可明顯減弱沉默F(xiàn)OXD2-AS1表達對肝癌細胞遷移、侵襲及其相關(guān)蛋白表達的抑制作用，MMP-2、MMP-9可通過降低細胞外基質(zhì)進而促進腫瘤細胞遷移〔23〕。本文結(jié)果提示沉默F(xiàn)OXD2-AS1表達可通過上調(diào)miR-122-5p表達降低肝癌細胞遷移及侵襲能力。

綜上，F(xiàn)OXD2-AS1可靶向調(diào)控肝癌細胞miR-122-5p表達，沉默F(xiàn)OXD2-AS1可通過誘導miR-122-5p表達減弱肝癌細胞增殖、遷移及侵襲能力，可為肝癌靶向治療提供新方向。