徐萌博 趙天增 楊金華

(南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院普胸外科,河南 南陽 473058)

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度大于200 bp的非編碼RNA，具有調(diào)節(jié)多種生物過程的潛能，目前已在多種類型腫瘤中發(fā)現(xiàn)lncRNA表達(dá)存在異常，作為腫瘤診斷、預(yù)后及靶向治療的潛在因子備受關(guān)注〔1，2〕。研究報(bào)道，lncRNA HOXA11-AS在胃癌〔3〕、結(jié)直腸癌〔4〕、宮頸癌〔5〕等腫瘤中表達(dá)上調(diào)，與腫瘤進(jìn)展有關(guān)，被認(rèn)為是腫瘤進(jìn)展的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。

微小RNA(miRNA)是一類長度約22 bp的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，在調(diào)控腫瘤進(jìn)展和放化療敏感性中都有良好應(yīng)用前景，是潛在的腫瘤分子標(biāo)志物〔6〕。miR-506被證實(shí)在肝癌〔7〕、胃癌〔8〕、結(jié)腸癌〔9〕等多種類型癌癥中，作為腫瘤抑制因子參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、遷移和侵襲。Yao等〔10〕報(bào)道，miR-506在食管癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，而過表達(dá)miR-506通過靶向癌基因CREB1抑制食管癌細(xì)胞增殖，在食管癌中起抑癌作用。

近年來，lncRNA與miRNA的調(diào)控作用為探討腫瘤發(fā)生發(fā)展過程和腫瘤靶向治療提供了新方向和新途徑。但目前HOXA11-AS對(duì)食管癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其在食管癌細(xì)胞中與miR-506是否存在靶向調(diào)控關(guān)系鮮有報(bào)道。本研究以食管癌細(xì)胞株Eca-109為研究對(duì)象，探討HOXA11-AS對(duì)食管癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及與靶向miR-506-3p的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株 食管癌細(xì)胞株Eca-109和人正常食管上皮細(xì)胞株HEEC由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供。

1.2主要試劑 胎牛血清和RPMI1640培養(yǎng)基購自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；胰蛋白酶購自北京索萊寶科技有限公司；噻唑藍(lán)(MTT)溶液和二甲基亞砜購自北京索萊寶科技有限公司；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；Trizol試劑購自Invitrogen公司；雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；陰性對(duì)照小干擾RNA(siRNA-NC)、HOXA11-AS-siRNA、pcDNA3.1空載體、pcDNA3.1-HOXA11-AS、miRNA陰性對(duì)照(miR-NC)、miR-506-3p-mimics、miRNA-inhibit陰性對(duì)照(anti-miR-NC)、miR-506-3p-inhibit(anti-miR-506-3p)均購自北京普爾普樂生物技術(shù)有限公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) 將適量人食管癌細(xì)胞和正常食管上皮細(xì)胞懸液加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃，5% CO2，濕度70%～80%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2天換液，檢測(cè)細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取第3～4代對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染、分組 將食管癌細(xì)胞隨機(jī)分為si-NC組(轉(zhuǎn)染siRNA-NC)、si-HOXA11-AS組(轉(zhuǎn)染HOXA11-AS-siRNA)、pcDNA組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體)、pcDNA-HOXA11-AS組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HOXA11-AS)、miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-506-3p組(轉(zhuǎn)染anti-miR-506-3p)、si-HOXA11-AS+anti-miR-NC組(共同轉(zhuǎn)染HOXA11-AS-siRNA和anti-miR-NC)、si-HOXA11-AS+anti-miR-506-3p組(共同轉(zhuǎn)染HOXA11-AS-siRNA和anti-miR-506-3p)。轉(zhuǎn)染方法參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染24 h檢測(cè)轉(zhuǎn)染成功后，更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 用胰酶消化收集si-NC組、si-HOXA11-AS組、miR-NC組、miR-506-3p組、si-HOXA11-AS+anti-miR-NC組和si-HOXA11-AS+anti-miR-506-3p組食管癌細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞制成3×104個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)24、48、72 h加入20 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸除培養(yǎng)孔中上清培養(yǎng)液，加入150 μl二甲基亞砜，低速震蕩10 min。酶標(biāo)儀上檢測(cè)每孔490 nm波長處光密度(OD)值。

1.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 調(diào)整“1.3”中各組細(xì)胞懸液密度為2×105個(gè)/ml，取1 ml細(xì)胞懸液加入無菌離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次，加入1倍結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，按照Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書，先加入5 μl Annexin V-FITC混勻，后加入10 μl PI混勻，室溫避光反應(yīng)10～15 min。1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.7RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中HOXA11-AS和miR-506-3p表達(dá) 收集對(duì)數(shù)生長期的正常食管上皮細(xì)胞和食管癌各組細(xì)胞，加入Trizol試劑抽提總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA提取質(zhì)量并進(jìn)行定量，使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，采用SYBR Green法進(jìn)行qPCR。HOXA11-AS的qPCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火1 min，共40個(gè)循環(huán)。miR-506-3p的qPCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性1 min，60℃退火30 s min，共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果以U6為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算HOXA11-AS和miR-506-3p相對(duì)表達(dá)水平。

1.8雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 生物信息學(xué)軟件TargetScan預(yù)測(cè)miR-506-3p是HOXA11-AS的靶基因。本研究將HOXA11-AS的3′UTR區(qū)(WT-HOXA11-AS)和突變3′UTR區(qū)(MUT-HOXA11-AS)與雙熒光素載體(pMIR-Report Luciferase載體)連接，分別與miR-NC、miR-506-3p-mimics共轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞，使用雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒和GloMax 20/20 發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)熒光素酶活性。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1HOXA11-AS和miR-506-3p在食管癌Eca-109細(xì)胞和正常食管上皮細(xì)胞HEEC中的表達(dá) RT-qPCR結(jié)果顯示，與正常食管上皮細(xì)胞HEEC比較，食管癌Eca-109細(xì)胞中HOXA11-AS表達(dá)明顯上調(diào)，miR-506-3p表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。見表1。

表1 HOXA11-AS和miR-506-3p在Eca-109細(xì)胞和HEEC細(xì)胞中的表達(dá)

2.2抑制HOXA11-AS表達(dá)對(duì)食管癌Eca-109細(xì)胞增殖的影響 與si-NC組比較，si-HOXA11-AS組食管癌中HOXA11-AS表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng)48、72時(shí)，si-HOXA11-AS組食管癌細(xì)胞增殖活性較si-NC組明顯下降(P<0.05)。見表2。

表2 抑制HOXA11-AS表達(dá)對(duì)食管癌Eca-109細(xì)胞增殖的影響

2.3抑制HOXA11-AS表達(dá)對(duì)食管癌Eca-109細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，與si-NC組〔7.61%±0.64%〕比較，si-HOXA11-AS組食管癌細(xì)胞凋亡率(20.13%±2.07%)明顯升高(t=10.009，P=0.001)。

2.4HOXA11-AS靶向調(diào)控miR-506-3p的表達(dá) 生物信息學(xué)軟件分析HOXA11-AS的3′UTR區(qū)能夠與miR-506-3p靶向結(jié)合。見圖1。

雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果，與miR-NC組比較，miR-506-3p組WT-HOXA11-AS活性明顯被抑制(P<0.05)，MUT-HOXA11-AS活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與si-NC組(0.47±0.05)比較，si-HOXA11-AS組細(xì)胞中miR-506-3p表達(dá)(1.02±0.09)明顯升高(P<0.05)；與pcDNA組(0.54±0.05)比較，pcDNA-HOXA11-AS組細(xì)胞中miR-506-3p表達(dá)(0.21±0.03)明顯降低(P<0.05)。

圖1 HOXA11-AS的序列中含有與miR-506-3p互補(bǔ)的核苷酸序列

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.5miR-506-3p過表達(dá)對(duì)食管癌Eca-109細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與miR-NC組比較，miR-506-3p組食管癌細(xì)胞中miR-506-3p表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，培養(yǎng)48 h和72 h時(shí)細(xì)胞增殖活性明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。見表4。

表4 miR-506-3p過表達(dá)對(duì)食管癌Eca-109細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.6抑制miR-506-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制HOXA11-AS表達(dá)對(duì)Eca-109細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與si-HOXA11-AS+anti-miR-NC組比較，si-HOXA11-AS+anti-miR-506-3p組食管癌細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，細(xì)胞培養(yǎng)48、72 h時(shí)增殖活性明顯增加(P<0.05)。見表5。

表5 抑制miR-506-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制HOXA11-AS表達(dá)對(duì)Eca-109細(xì)胞增殖和凋亡的影響

3 討 論

我國是全球食管癌高發(fā)地區(qū)，食管癌發(fā)病率和死亡率約占全球的50%，是我國癌癥死亡的重要原因之一〔11〕。食管癌預(yù)后較差，據(jù)報(bào)道食管癌在發(fā)達(dá)國家的5年生存率約為18%，而在多數(shù)發(fā)展中國家其5年生存率不足5%〔12，13〕。近年來隨著分子靶向藥物在腫瘤中的研發(fā)應(yīng)用，食管癌的分子靶向治療也取得了一定進(jìn)展，但仍存在明顯不足，迫切需要尋找特異性更好、更有針對(duì)性的分子靶點(diǎn)，指導(dǎo)結(jié)腸癌早期診斷、治療及預(yù)后評(píng)估。

lncRNA HOXA11-AS是新發(fā)現(xiàn)的具有致癌性的lncRNA，可通過與miRNA、細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)蛋白等互作促進(jìn)腫瘤進(jìn)展〔14〕。孫曉燕等〔15〕報(bào)道，HOXA11-AS在食管癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，與食管癌組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，是患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果提示，HOXA11-AS可能是食管癌靶向治療的靶點(diǎn)。以往研究表明miR-506-3p在腫瘤中多被下調(diào)，通過靶向癌基因、細(xì)胞周期等起到腫瘤抑制劑的作用。Guo等〔16〕報(bào)道，miR-506-3p在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，與腫瘤大小、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，與患者不良預(yù)后有關(guān)，其作用與靶向癌基因COTL1有關(guān)。Jiashi等〔17〕報(bào)道，骨肉瘤中miR-506-3p表達(dá)抑制導(dǎo)致Ras相關(guān)蛋白R(shí)AB3D表達(dá)增加，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞周期相關(guān)蛋白活性增加，導(dǎo)致骨肉瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，而過表達(dá)miR-506-3p有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果說明miR-506-3p在食管癌中也發(fā)揮腫瘤抑制作用。

隨著人類基因組中非編碼RNA研究的深入，越來越多的證據(jù)表明，lncRNA和miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中存在相互調(diào)控關(guān)系，對(duì)腫瘤早期診斷、治療等具有重要指導(dǎo)意義〔15～18〕。Huang等〔19〕報(bào)道，lncRNA NEAT1在胰腺癌中起致癌作用，通過靶向負(fù)調(diào)控miR-506-3p促進(jìn)胰腺癌進(jìn)展。提示靶向lncRNA-miRNA具有腫瘤診斷、治療的潛能。本研究通過生物信息學(xué)軟件分析和相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，食管癌細(xì)胞中HOXA11-AS表達(dá)上調(diào)能夠靶向抑制miR-506-3p表達(dá)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)抑制HOXA11-AS的食管癌細(xì)胞相比，同時(shí)抑制HOXA11-AS和miR-506-3p，食管癌細(xì)胞增殖能力恢復(fù)，細(xì)胞凋亡率明顯降低，說明抑制HOXA11-AS對(duì)食管癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響與miR-506-3p表達(dá)有關(guān)。

綜上，食管癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA HOXA11-AS表達(dá)上調(diào)，抑制HOXA11-AS能夠有效抑制食管癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與靶向負(fù)調(diào)控miR-506-3p的表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果表明，HOXA11-AS是食管癌靶向治療的潛在靶點(diǎn)，并為HOXA11-AS在食管癌靶向治療中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，但其靶基因miR-506-3p對(duì)食管癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。