豆春麗，袁芳芳，劉斌，李慧，蘇磊,5*

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣州 510006；2中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院血液科，長沙 410013；3長沙市第一醫(yī)院急診科，長沙 410005；4南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科 廣州，510010；5全軍熱區(qū)創(chuàng)傷救治與組織修復(fù)重點實驗室，廣州 510010

重癥中暑是以核心體溫升高(＞40 ℃)、水電解質(zhì)紊亂及中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙為特征的熱性疾病，并伴有全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)和多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)[1-3]。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國重癥中暑病死率為10%～15%，合并MODS時則高達(dá)40%，即使存活者也有30%以上遺留神經(jīng)、骨骼肌等系統(tǒng)的后遺癥。本團(tuán)隊前期研究發(fā)現(xiàn)，臟器損傷數(shù)目及程度與重癥中暑的預(yù)后密切相關(guān)，防治單一器官衰竭進(jìn)展至MODS，在重癥中暑的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸過程中可能起關(guān)鍵作用。既往研究表明，橫紋肌溶解(rhabdomyolysis，RM)是重癥中暑尤其勞力型重癥中暑的常見合并癥[4]，橫紋肌溶解綜合征發(fā)生后其并發(fā)癥發(fā)生率高達(dá)51%，病死率高達(dá)32%，但中暑引起RM的具體機(jī)制尚不清楚[5]。研究表明，RM因肌細(xì)胞損傷及ATP能量代謝障礙致使橫紋肌細(xì)胞廣泛死亡，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性改變引起細(xì)胞內(nèi)容物溢出，引發(fā)一系列危及生命的嚴(yán)重并發(fā)癥。但目前針對重癥中暑引起骨骼肌細(xì)胞損傷的相關(guān)研究較少。細(xì)胞脹亡是一種區(qū)別于凋亡的、caspase非依賴性的重要的促炎性細(xì)胞死亡方式，與急性冠脈綜合征、心肌缺血-再灌注損傷及惡性腫瘤等多種疾病密切相關(guān)[6-8]。但細(xì)胞脹亡是否參與重癥中暑RM的發(fā)生目前尚不清楚。本研究探討熱應(yīng)激過程中骨骼肌細(xì)胞發(fā)生損傷的具體形式，以及重癥中暑RM的發(fā)生機(jī)制，以期為臨床救治提供靶點。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 Porimin(G-2)抗體(sc-377295)購自美國Santa公司；CCK-8試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)毒性檢測試劑盒、ECL發(fā)光液購自碧云天生物技術(shù)研究所；Annexin Ⅴ-FITC/PI試劑盒購自貝博公司；GAPDH抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；羊抗鼠IgG(H+L)-HRP、羊抗兔IgG(H+L)-HRP購自北京銳抗生物科技有限公司；caspase-3抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。普通倒置顯微鏡(YSK-319)購自日本Olympus公司；多孔板離心機(jī)購自杭州瑞誠儀器有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher公司；透射電子顯微鏡購自日本日立新公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 人骨骼肌細(xì)胞株(HSKMC) 購自北納生物。HSKMC細(xì)胞復(fù)蘇后，1000 r/min離心5 min，棄上清，用高糖DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、10萬U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素)重懸，轉(zhuǎn)入6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長情況每2～3 d傳代1次，每周傳代2或3次。普通倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞長至對數(shù)生長期時進(jìn)行后續(xù)試驗，按照不同的處理方式分為對照組與熱打擊組。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞活力 取對數(shù)生長期細(xì)胞，按100 μl/孔(5×104個細(xì)胞)的密度接種于96孔板中，待貼壁穩(wěn)定后，對照組細(xì)胞于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育；熱打擊組細(xì)胞于43 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h建立熱打擊細(xì)胞損傷模型，然后置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育0、6、12、24 h，分別設(shè)置5個復(fù)孔。復(fù)溫后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，并將培養(yǎng)板置于37 ℃孵箱內(nèi)孵育2 h。按照CCK-8試劑盒說明書操作，應(yīng)用酶標(biāo)儀測定450 nm處各孔吸光度(OD)值，計算細(xì)胞活力。

1.2.3 LDH法檢測細(xì)胞毒性 將適量細(xì)胞接種于96孔板中，待細(xì)胞長滿至80%～90%時進(jìn)行檢測。各組細(xì)胞處理結(jié)束后，將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400g離心5 min，吸除上清，加入150 μl LDH釋放試劑，混勻，重新置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h。然后將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400g離心5 min。取各孔的上清液120 μl，轉(zhuǎn)移到新96孔板相應(yīng)孔中，分別向各孔中加入60 μl LDH檢測工作液，混勻，室溫下避光孵育30 min，用酶標(biāo)儀測定490 nm處各孔OD值，計算細(xì)胞毒性。

1.2.4 透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 熱打擊處理后，在各時間點收集細(xì)胞，用2.5%戊二醛固定液固定，4 ℃過夜，送南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗科，透射電子顯微鏡下觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。

1.2.5 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染色法檢測雙陽性細(xì)胞率 按Annexin Ⅴ-FITC/PI試劑盒說明書步驟操作。熱打擊處理后，在不同時間點收集細(xì)胞，調(diào)整待測細(xì)胞濃度為1×106個/ml，預(yù)冷PBS潤洗2次，用400 μl(1×) Annexin Ⅴ結(jié)合液重懸細(xì)胞，在細(xì)胞懸液中加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC染色液，輕輕混勻并于4 ℃避光放置15 min，加入10 μl PI輕輕混勻并于4 ℃避光放置5 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm)。

1.2.6 Western blotting檢測細(xì)胞porimin、caspase-3蛋白的表達(dá) 取對數(shù)生長期細(xì)胞(熱打擊后不同復(fù)溫時間點及對照組)，加入細(xì)胞裂解液(RIPA:PMSF=100:1)，提取總蛋白，采用BCA法定量總蛋白濃度，然后行SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5% BSA室溫封閉1 h，洗膜后加入porimin一抗(1:500)、caspase-3一抗(1:1000)，4 ℃過夜，TBST洗3 次，5 m in/次，加入二抗(1:10 000)室溫孵育1 h，TBST洗3次，5 min/次， 使用化學(xué)發(fā)光劑ECL顯色、曝光。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，若方差齊，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗；若方差不齊，兩樣本均數(shù)比較采用t'檢驗；多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，若方差齊，組間比較采用LSD-t檢驗；若方差不齊，組間比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 熱打擊對HSKMC細(xì)胞活力及毒性的影響 CCK-8法檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，熱打擊組復(fù)溫0h細(xì)胞活力即開始下降，且隨著時間的延長細(xì)胞活力不斷下降，呈時間依賴性(P＜0.05)。LDH法檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，熱打擊組復(fù)溫0h細(xì)胞毒性即增強，且隨著時間的延長細(xì)胞毒性不斷增強，呈時間依賴性(P＜0.05，圖1)。

2.2 熱打擊后HSKMC細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化情況 透射電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞表面具有豐富的微絨毛，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)清晰，核大濃染，形態(tài)不規(guī)則，染色質(zhì)濃密，核仁大而清晰。熱打擊組細(xì)胞在復(fù)溫早期(0、6 h)表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹、體積變大，胞質(zhì)空泡化(有別于凋亡早期的細(xì)胞皺縮、胞質(zhì)濃縮及出芽改變)，線粒體明顯腫脹，脫顆粒，雙嵴消失，核周間隙增寬，細(xì)胞核凝聚、固縮，部分包膜連續(xù)性中斷，符合脹亡早期表現(xiàn)；復(fù)溫晚期(12、24 h)表現(xiàn)為核仁溶解消失，細(xì)胞核碎裂、染色質(zhì)邊集，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)崩解呈顆粒狀，符合脹亡晚期表現(xiàn)，即脹亡樣壞死(圖2)。

2.3 熱打擊對HSKMC細(xì)胞雙陽性細(xì)胞率的影響 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染色法檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，熱打擊組雙陽性細(xì)胞率呈進(jìn)行性增高趨勢(P＜0.05，圖3)。

2.4 熱打擊對HSKMC細(xì)胞中porimin、caspase-3蛋白表達(dá)的影響 Western blotting檢測結(jié)果顯示，隨著復(fù)溫時間的延長，porimin蛋白表達(dá)呈增強趨勢，至復(fù)溫12 h時，表達(dá)最強(P＜0.05)。與對照組相比，caspase-3蛋白表達(dá)無明顯剪切活化(P＞0.05，圖4)。

圖1 熱打擊后不同復(fù)溫時間點HSKMC細(xì)胞活力及毒性的變化情況(n=3)Fig.1 Changes in HSKMCs viability and toxicity at different rewarming time points after heat stroke(n=3)

圖2 熱打擊后HSKMC細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化情況(×8000)Fig.2 Changes of ultrastructure of HSKMCs after heatstroke(×8000)

圖3 熱打擊對不同復(fù)溫時間點HSKMC細(xì)胞雙陽性細(xì)胞率的影響Fig.3 The double positive cell rate in HSKMCs at different rewarming points after heat stroke

圖4 熱打擊后不同復(fù)溫時間點HSKMC細(xì)胞中porimin (A)、caspase-3蛋白(B)的表達(dá)Fig.4 Expression of porimin (A) and caspase-3 protein (B) in HSKMCs at different rewarming time points after heat stroke

3 討 論

重癥中暑是一種高發(fā)病率和高致死率的疾病[9]， 且合并MODS時病死率高達(dá)40%，RM是重癥中暑常見的并發(fā)癥[3]。重癥中暑骨骼肌損傷時，骨骼肌細(xì)胞的死亡方式尚未見報道。細(xì)胞脹亡是一種非典型的程序性細(xì)胞死亡方式，與線粒體功能障礙及胞內(nèi)ATP迅速減少有關(guān)，是近年來的研究熱點[6-7,10]。因此，本研究探討熱應(yīng)激過程中骨骼肌細(xì)胞發(fā)生損傷的具體形式，建立HSKMC細(xì)胞重癥中暑模型并檢測細(xì)胞活力及毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，熱打擊可導(dǎo)致HSKMC細(xì)胞損傷。

細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化是判斷細(xì)胞死亡方式的一項重要標(biāo)準(zhǔn)，也是判斷脹亡的有效方法。本研究采用透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞表面具有豐富的微絨毛，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)清晰，核大濃染，形態(tài)不規(guī)則，染色質(zhì)濃密，核仁大而清晰，熱打擊組細(xì)胞在復(fù)溫早期(0、6 h)表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹、體積變大，胞質(zhì)空泡化(有別于凋亡早期的細(xì)胞皺縮、胞質(zhì)濃縮及出芽改變)，線粒體明顯腫脹，脫顆粒，雙嵴消失，核周間隙增寬，細(xì)胞核凝聚、固縮，部分包膜連續(xù)性中斷，符合脹亡早期表現(xiàn)；復(fù)溫晚期(12、24 h)表現(xiàn)為核仁溶解消失，細(xì)胞核碎裂、染色質(zhì)邊集，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)崩解呈顆粒狀，符合脹亡晚期表現(xiàn)(即脹亡樣壞死)。上述特征與細(xì)胞脹亡的形態(tài)學(xué)特征一致[11]。此外，通過流式細(xì)胞儀檢測PI與Annexin Ⅴ-FITC的結(jié)合情況，也可判斷細(xì)胞是否發(fā)生脹亡[12]。脹亡細(xì)胞可以與Annexin-Ⅴ、PI結(jié)合，呈現(xiàn)紅色和綠色熒光[Annexin-Ⅴ(+)、PI(+)]，即“雙陽性細(xì)胞”。本研究發(fā)現(xiàn)，熱打擊可導(dǎo)致HSKMC細(xì)胞出現(xiàn)雙陽性細(xì)胞，且呈時間依賴性。Caspase-3可啟動細(xì)胞凋亡[13]，本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，熱打擊后HSKMC細(xì)胞中caspase-3蛋白無明顯變化，表明熱打擊后骨骼肌細(xì)胞并未發(fā)生凋亡。Moinfar等[14]成功克隆并初步證實porimin特異性地表達(dá)于將要發(fā)生脹亡的細(xì)胞表面。Porimin是介導(dǎo)細(xì)胞脹亡的特異性蛋白，本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，熱打擊導(dǎo)致HSKMC細(xì)胞中porimin蛋白的表達(dá)增強，并呈時間依賴性。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，熱打擊誘導(dǎo)HSKMC細(xì)胞發(fā)生了一種有別于細(xì)胞凋亡的caspase非依賴性細(xì)胞死亡方式——脹亡。