梁 音，張 劍，王新衛(wèi)，劉新年，張海英

0 引 言

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種慢性氣道炎性疾病，其特征主要是氣道慢性炎癥、氣道高反應(yīng)、氣道重塑，發(fā)病率和死亡率在全世界范圍內(nèi)呈逐漸上升趨勢，是危害人類健康的常見疾病之一，已成為世界性的公共衛(wèi)生難題。目前，該病病因被認(rèn)為是由多種細(xì)胞參與的慢性氣道炎癥所致，其中包括多種細(xì)胞(如氣道上皮細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等)和細(xì)胞組分等[1-3]。miRNA-155是一種多功能非蛋白編碼的小RNA，在各種生理和病理過程中發(fā)揮作用，包括炎癥、免疫和造血。此外，除自身免疫性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎外，miRNA-155在不同過敏性疾病和特應(yīng)性皮炎的發(fā)病機(jī)制中也具有重要作用，miRNA-155的過度表達(dá)已被證實(shí)與哮喘的發(fā)展和促過敏細(xì)胞的激活有關(guān)[4-6]。Wnt5a是Wnt蛋白家族中非常重要的成員之一，在炎癥性疾病中發(fā)揮重要而復(fù)雜的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，Wnt5a在炎癥反應(yīng)中既能誘導(dǎo)炎癥因子發(fā)揮促炎作用，又能誘導(dǎo)某些抑炎因子發(fā)揮抗炎作用[7]。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)是在炎癥和癌癥中通過磷酸化從細(xì)胞質(zhì)穿梭到核而被激活[8]。研究表明，STAT3對炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生至關(guān)重要，它們的激活與氣道炎癥的發(fā)生有關(guān)[9]。本研究旨在探討miRNA-155通過Wnt5a調(diào)控STAT3信號通路在哮喘發(fā)生發(fā)展中的作用，為臨床治療哮喘提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康SD雄性大鼠共36只，8～12周，體重250～270 g，購自中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號：SYXK(滇)K2017-0009。大鼠飼養(yǎng)期間光照明暗交替周期為12 h、溫度23～25 ℃，相對濕度40%～70%。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑miRNA-155抑制物及陰性對照(上海吉瑪生物公司)、LipofectamineTM-2000、TRIzol Reagent、miRNA-155、U6引物(均購自美國Invitrogen公司)、Wnt5a、GAPDH普通PCR上下游引物(北京六合華大基因科技股份有限公司)、SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa)、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific)、人氣道上皮細(xì)胞-16-HBE細(xì)胞(上海博谷生物科技有限公司)、DMEM培養(yǎng)基(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)、中性樹膠(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、HE染液(武漢賽維爾生物科技有限公司)、RIPA裂解液(北京索萊寶科技有限公司)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(Thermo公司)、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Elabscience公司)、Wnt5a兔抗鼠單抗、STAT3兔抗鼠單抗(均購自Abcam公司)、p-STAT3兔抗鼠單抗(美國CST公司)、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(Santa Cruze公司)、大鼠IL-6、TNF-α ELISA試劑盒(均購自南京建成生物工程研究所)；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器Mater Screen Paed肺功能儀(德國耶格公司)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司)、Centrifuge5810R型高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)、電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad公司)、酶標(biāo)儀(Thermo公司)、搖床(上海精密儀器制造公司)、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(GE公司)、脫水機(jī)和包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司 )、HM315-標(biāo)準(zhǔn)的輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(德國美康公司)、正置光學(xué)顯微鏡(德國萊卡公司)。

1.2 建立動(dòng)物模型和分組參照文獻(xiàn)[10]建立哮喘大鼠模型，第1、8天分別腹腔內(nèi)注射10% 卵清蛋白(OVA)和10%氫氧化鋁混合液1.0 mL(OVA和氫氧化鋁各10 g加入100 mL無菌等滲鹽水中)致敏，于OVA致敏后第15天開始霧化激發(fā)，將大鼠置于一密閉玻璃容器(40 cm×50 cm×60 cm)中，給予1% OVA(1 g OVA加入100 mL無菌等滲鹽水中)霧化吸入(霧粒直徑3～5 μm)，每周激發(fā)5次，每次30 min，以大鼠出現(xiàn)呼吸加快，口唇發(fā)紺、站立不穩(wěn)等表現(xiàn)為激發(fā)成功，連續(xù)激發(fā)8周。將SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組、陰性對照組和miRNA-155表達(dá)抑制組，每組12只，陰性對照組大鼠在哮喘模型建立后轉(zhuǎn)染NC 拮抗物；miRNA-155表達(dá)抑制組大鼠在哮喘模型建立后轉(zhuǎn)染miRNA-155 拮抗物；正常對照組以等滲鹽水代替OVA致敏和激發(fā)，連續(xù)處理7 d后處死觀察。麻醉處死后取肺組織。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 采用肺功能檢測儀進(jìn)行肺功能檢測將大鼠麻醉后固定于手術(shù)板，打開喉鏡行氣管插管，然后連接Mater Screen Paed肺功能儀，測定用力肺活量(FVC)、第一秒用力呼氣量(FEV1)、一秒率(FEV1/ FVC)、呼氣峰流量(PEF)。

1.3.2 采用HE染色法觀察肺組織損傷情況將肺組織用0.9%等滲鹽水漂洗、濾紙、吸干，放入4%多聚甲醛固定液中固定48 h，然后進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片。病理切片厚度為4 μm。將病理切片放置于65 ℃烘箱2 h后，依次放入二甲苯20 min、無水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、50%乙醇各5 min。蘇木精、酒精-伊紅染色，中性樹脂封固，鏡下觀察組織形態(tài)及病理改變。

1.3.3 采用RT-PCR法檢測各組大鼠肺組織miRNA-155、Wnt5a mRNA表達(dá)水平Trizol法提取大鼠肺組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，采用SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測各組miRNA-155和Wnt5a基因的表達(dá)水平。引物設(shè)計(jì)如下：miRNA-155上5′-CGTTAATGCTAATCGTGATAG-3′，下游5′-GCAGGGTCCGAGGT-3′；U6上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；Wnt5a上5′-CATCGGAGCACAGCCTCTCTG-3′，下游5′-CACTCTTTGATGCCCGTCTT-3′；GAPDH上游5′-TCCATGACAACTTTGGCATTG-3′，下游5′-TCACGCCACAGCTTTCCA-3′。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，59 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本重復(fù)檢測3次。每組miRNA-155、Wnt5a基因的相對表達(dá)量按公式(2-△△Ct法)計(jì)算。

1.3.4 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)采用生物信息學(xué)軟件TargetScan等數(shù)據(jù)庫分析miRNA-155的靶基因，結(jié)果顯示W(wǎng)nt5a基因3′端存在miRNA-155的結(jié)合位點(diǎn)，提示W(wǎng)nt5a可能是miRNA-155的直接靶基因。采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證該結(jié)果，分別擴(kuò)增出含miRNA-155結(jié)合位點(diǎn)的Wnt5a 3′UTR及miRNA-155結(jié)合位點(diǎn)突變的Wnt5a 3′UTR系列，將其插入到熒光素酶報(bào)告基因載體上，構(gòu)建野生型Wnt5a-Wt和突變型Wnt5a-Mut重組質(zhì)粒。將人氣道上皮細(xì)胞(16-HBE細(xì)胞)接種到含10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，分別將Wnt5a-Wt重組質(zhì)粒、Wnt5a-Mut重組質(zhì)粒與miRNA-155 Inhibitor或miRNA-155Inhibitor NC共轉(zhuǎn)染至人氣道上皮細(xì)胞(16-HBE細(xì)胞)中，置于37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集并裂解細(xì)胞，使用雙熒光素酶報(bào)告基因分析。

1.3.5 采用Western blot法檢測各組大鼠肺組織Wnt5a、STAT3、p-STAT3的蛋白表達(dá)水平取肺組織加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取50 μg上樣經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳后，半干轉(zhuǎn)至PVDF膜上，將目的條帶用5%脫脂奶粉中封閉1 h，TBST洗膜后加入一抗(1∶2000稀釋)，4 ℃過夜孵育，TBST洗膜后再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶3000稀釋)，室溫下1 h，TBST洗膜后以ECL化學(xué)發(fā)光，于暗室成像拍照，以GAPDH為內(nèi)標(biāo)蛋白，計(jì)算各組蛋白相對表達(dá)水平。

1.3.6 采用ELISA法分別檢測肺組織勻漿IL-6、TNF-α表達(dá)水平取肺組織置于玻璃勻漿器中，按體重體積比1∶9加入等滲鹽水在冰浴中充分研磨，制成10%肺勻漿，然后以離心半徑12 cm、5000 r/min離心10 min取上清，ELISA法檢測各組大鼠肺勻漿中炎性細(xì)胞因子IL-6、TNF-α的表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肺功能結(jié)果與正常對照組相比，陰性對照組、miRNA-155表達(dá)抑制組大鼠肺功能指標(biāo)FVC、PEF 、FEV1均顯著降低(P<0.05)，F(xiàn)EV1/FVC升高(P<0.05)；與陰性對照組相比，miRNA-155表達(dá)抑制組大鼠FVC、PEF 、FEV1和FEV1/FVC差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠肺功能結(jié)果

2.2 各組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)比較光鏡下觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常對照組肺組織及支氣管上皮結(jié)構(gòu)完整、肺泡腔清晰、纖毛排列整齊、基本無或偶見少量炎癥反應(yīng)；陰性對照組肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，肺泡壁彌漫性增厚，有明顯的炎性細(xì)胞浸潤；miRNA-155表達(dá)抑制組病理改變較組明顯減輕，表明抑制miRNA-155表達(dá)可改善哮喘大鼠肺組織病理變化。見圖1。

a:正常對照組; b:陰性對照組; c:miRNA-155表達(dá)抑制組

2.3 各組大鼠肺組織miRNA-155和Wnt5a mRNA表達(dá)水平與正常對照組比較，陰性對照組、miRNA-155表達(dá)抑制組miRNA-155表達(dá)水平升高(P<0.05)，Wnt5a表達(dá)降低(P<0.05)；與陰性對照組相比，miRNA-155表達(dá)抑制組miRNA-155表達(dá)水平降低，Wnt5a基因mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見圖2。

a:miRNA-155; b:Wnt5a mRNA

2.4 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miRNA-155與Wnt5a的靶向關(guān)系雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分析結(jié)果顯示，miRNA-155與Wnt5a基因3′UTR存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，miRNA-155和Wnt5a能夠靶向結(jié)合，miRNA-155:3′ugggGAUAGU—GCUAAUCGUAAUu5′,Wnt5a:5′ attgCTCACATTCTTTTAGCATTAt 3′。熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示，miRNA-155表達(dá)抑制組Wnt5a-WT 3′UTR的熒光素酶活性較陰性對照組相比升高(P<0.05)。見圖3。

與陰性對照組相比，*P<0.05

2.5 各組大鼠肺組織Wnt5a、STAT3、p-STAT3的蛋白表達(dá)水平與正常對照組相比，陰性對照組Wnt5a的蛋白表達(dá)水平降低而STAT3、p-STAT3的蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與陰性對照組比較，miRNA-155表達(dá)抑制組Wnt5a蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，而STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見圖4。

1:正常對照組; 2:陰性對照組; 3:miRNA-155表達(dá)抑制組

2.6 各組大鼠肺組織勻漿IL-6、TNF-α表達(dá)水平與正常對照組相比，陰性對照組、miRNA-155表達(dá)抑制組大鼠肺組織IL-6、TNF-α表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)；而miRNA-155表達(dá)抑制組IL-6、TNF-α表達(dá)水平均顯著低于陰性對照組(P<0.05)。見表2。

表 2 各組大鼠肺組織IL-6、TNF-α的表達(dá)水平

3 討 論

哮喘是以T淋巴細(xì)胞及肥大細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞和細(xì)胞組分共同參與的一種肺部炎癥性疾病，過敏原可以誘發(fā)哮喘[11-12]。由于哮喘本身是一種由多種細(xì)胞介導(dǎo)的氣道慢性炎癥反應(yīng)，其中CD4+T細(xì)胞在其發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-155在哮喘小鼠肺組織及脾CD4+T細(xì)胞中的表達(dá)升高，并且隨著接觸過敏原時(shí)間的增加水平顯著升高，在哮喘發(fā)病過程中CD4+T細(xì)胞內(nèi)存在miRNA-155的內(nèi)在調(diào)節(jié)作用[14]。研究表明，與未被激發(fā)的小鼠相比，在卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)激發(fā)的小鼠的肺中，miRNA-155表達(dá)顯著上調(diào)。與野生型小鼠相比，miRNA-155敲減小鼠的肺部粘液生成和炎癥細(xì)胞，特別是由OVA哮喘誘導(dǎo)的嗜酸細(xì)胞均顯著減少。miRNA-155在過敏性炎癥中起著關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[15-16]。

本研究采用10% OVA和10%氫氧化鋁混合液1.0 mL致敏后給予1% OVA霧化吸入建立哮喘大鼠模型，建模后進(jìn)行miRNA-155抑制劑轉(zhuǎn)染及干擾Wnt5a表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，陰性對照組、miRNA-155表達(dá)抑制組大鼠肺功能指標(biāo)FVC、FEV1及PEF均顯著降低而FEV1/ FVC升高；與陰性對照組相比，miRNA-155表達(dá)抑制組大鼠肺功能均有不同程度的提高。組織病理形態(tài)學(xué)結(jié)果表明抑制miRNA-155表達(dá)可改善哮喘大鼠肺組織病理變化。與正常對照組比較，陰性對照組miRNA-155表達(dá)水平升高，Wnt5a基因mRNA表達(dá)水平顯著降低；與陰性對照組相比，miRNA-155表達(dá)抑制組miRNA-155表達(dá)水平降低，Wnt5a基因mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高。進(jìn)一步采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miRNA-155與Wnt5a的靶向關(guān)系，結(jié)果顯示，miRNA-155與Wnt5a基因3′UTR存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，Wnt5a是miRNA-155的靶基因。提示miRNA-155與Wnt5a呈負(fù)性表達(dá)，哮喘大鼠模型肺功能受損，肺組織結(jié)構(gòu)破壞，炎性細(xì)胞浸潤明顯，而抑制miRNA-155表達(dá)水平可提高哮喘大鼠肺功能水平并可減輕肺組織炎性細(xì)胞浸潤，從而改善大鼠哮喘。

作為轉(zhuǎn)錄因子，STAT3可調(diào)節(jié)各種細(xì)胞因子(包括TNF-α，IL-1β等)和免疫調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)[17]。楊遠(yuǎn)艦等[18]發(fā)現(xiàn)，使用屋塵螨抗原P1刺激16-HBE細(xì)胞建立哮喘模型，細(xì)胞中p-STAT3的蛋白水平顯著升高，且細(xì)胞存活率降低；干擾STAT3后，16-HBE細(xì)胞的存活率出現(xiàn)回升，結(jié)果提示STAT3可能與哮喘所致支氣管上皮細(xì)胞損傷有關(guān)。而miRNA-155作為STAT3信號通路的上游，可激活STAT3炎癥通路促進(jìn)炎癥因子的生成和釋放，但miRNA-155通過何種途徑引起炎癥反應(yīng)目前尚不清楚[19-20]。張曉亮等[21]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miRNA-155模擬物上調(diào)miRNA-155后，可顯著增加STAT3、p-STAT3的蛋白表達(dá)水平；抑制miRNA-155表達(dá)則后可顯著抑制STAT3、p-STAT3的表達(dá)。本研究Western blot結(jié)果顯示，與正常對照組相比，陰性對照組、miRNA-155表達(dá)抑制組STAT3、p-STAT3的蛋白表達(dá)水明顯升高；miRNA-155表達(dá)抑制組STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)水平與陰性對照組相比顯著降低。提示miRNA-155可促進(jìn)STAT3信號通路激活，從而在哮喘中發(fā)揮炎癥作用。

IL-6為致炎性細(xì)胞因子，可激活STAT3的磷酸化，活化的STAT3信號通路是感染時(shí)致炎因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要通路[22]。目前研究認(rèn)為炎性細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡在哮喘的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用。因此，本研究還檢測了miRNA-155在哮喘大鼠模型中是否涉及炎癥因子的釋放，結(jié)果表明與正常對照組相比，陰性對照組、miRNA-155表達(dá)抑制組大鼠肺組織IL-6、TNF-α表達(dá)水平均顯著升高；miRNA-155表達(dá)抑制組IL-6、TNF-α表達(dá)水平均顯著低于陰性對照組。提示miRNA-155引起炎癥因子的釋放，提高哮喘大鼠肺組織炎性水平，促進(jìn)病情的發(fā)展。

綜上所述，miRNA-155通過靶向Wnt5a激活STAT3信號通路，導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子升高，促進(jìn)哮喘大鼠的發(fā)生發(fā)展，miRNA-155可能成為治療哮喘的新靶點(diǎn)。