李彩虹 ，榮朵艷 ，廖曉珊, ，張邦躍

（1.湖南工業(yè)大學 生命科學與化學學院，湖南 株洲 412007；2.湖南工業(yè)大學 百合種質(zhì)資源創(chuàng)新與深加工湖南省工程研究中心，湖南 株洲 412007；3.株洲市農(nóng)業(yè)科學研究所，湖南 株洲 412007）

1 研究背景

紅花檵木（Loropetalum chinensevar.rubrum）整株富含紅色花青苷物質(zhì)，觀賞價值高，是我國南方地區(qū)常用的園林綠化植物[1-2]。1905年Molish 首次發(fā)現(xiàn)了花青苷晶體，花青苷是由花色素與各種糖形成的糖苷，它的基本結(jié)構(gòu)是3,5,7-三羥基-2-苯基苯并吡喃。花青苷的生物合成途徑在矮牽牛（Petunia hybrida Vilmorin）、金魚草（Antirrhinum majusL.）、葡萄（Vitis viniferaL.）等模式植物上已經(jīng)取得了較大的進展?；ㄇ嘬赵暮铣墒腔ㄇ嘬丈锖铣傻暮诵摹Ｄ壳?，花青苷在植物體內(nèi)的合成途徑已經(jīng)基本明確，其合成途徑是類黃酮物質(zhì)合成的一個分支。紅花檵木中，花青苷物質(zhì)也是決定其觀賞價值的關鍵因素，在植物的花、葉、果皮等組織的著色過程中起著重要作用，同時也參與植物響應生物與非生物脅迫過程[3]。因此，通過開展紅花檵木的花青苷物質(zhì)合成研究，不僅對深入了解紅花檵木花青苷的合成途徑提供依據(jù)，而且也對促進紅花檵木的育種具有現(xiàn)實意義。在植物花青苷生物合成過程中，查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS）是第一個限速酶，催化底物4-香豆酰CoA 和丙二酰-CoA 發(fā)生反應，包括了三個步驟的反應過程：底物的加載反應、丙二?；擊确磻? 次聚酮化合物延伸反應，從而環(huán)化形成花青苷物質(zhì)的基本骨架[4-5]。

目前，科研工作者已經(jīng)對很多植物中CHSs 的生物學功能進行了研究，特別是其在花青苷物質(zhì)生物合成過程中的功能取得了較多的研究成果。CHS 作為花青苷合成途徑的第一個關鍵酶類，對花青苷物質(zhì)的積累是必需的。在發(fā)生基因共抑制（cosuppression）或自然沉默的矮牽牛（Petunia hybrida）中，PhCHS-A基因在花朵部分區(qū)域的表達受到抑制，PhCHS-A受抑制的部分區(qū)域不合成花青苷而顯白色，從而形成雙色花[6]。利用嘧螨脂能夠抑制矮牽牛PhCHS-A的轉(zhuǎn)錄后沉默，從而促進花朵中花青苷物質(zhì)的合成[7]。對雙色花的大麗花（Dahlia variabilis）的研究也表明，DvCHS2 基因在花朵部分區(qū)域發(fā)生了轉(zhuǎn)錄后沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS），從而造成同一朵花形成紅白雙色花，而在富含類黃酮葉片中DvCHS2 基因的表達量也遠遠高于那些低類黃酮含量的葉片[8]。通過RNAi 下調(diào)藍豬耳（Torenia hybrida）的ThCHS基因的表達，花朵的顏色由藍色變?yōu)闇\色或白色[9]。干擾蘋果（Malus×domestica）中MdCHSs基因的表達，轉(zhuǎn)基因株系的莖、花瓣及果皮中不能生成花青苷而表現(xiàn)為綠色，同時二氫查爾酮和類黃酮含量也在轉(zhuǎn)基因株系中急劇降低[10-11]。利用病毒誘導基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）技術瞬時干擾獼猴桃中AeCHS基因的表達，AeCHS基因表達下調(diào)的花瓣顏色變淺、花青苷含量降低[12]。此外，海棠（Malus crabapple）的McCHS[13]、香雪蘭（Freesia hybrid）的FhCHS1[14]和紫丁香（Syringa oblataLindl.）的SoCHS[15]也與相應植物中花青苷物質(zhì)的積累緊密相關，這些基因的異源過表達可導致轉(zhuǎn)基因植株花朵顏色變深。

本文基于紅花檵木葉片轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，篩選到兩個CHS同源基因，分別命名為LcCHS1 和LcCHS2。其中LcCHS1 與之前報道的LcvrCHS1 的核苷酸序列一致性很高[16]，但LcvrCHS1 只有本文中LcCHS1 的部分ORF（open reading frame，ORF）序列，且LcvrCHS1 基因的推導氨基酸缺乏CHS 酶的特征序列（“GVLFGFGPGL”）。通過對轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析所篩選到的LcCHS1 和LcCHS2 基因的克隆及生物信息學分析，將有利于提升對紅花檵木花青苷生物合成機制的了解，為進一步開發(fā)紅花檵木的經(jīng)濟價值以及紅花檵木品種的改良創(chuàng)造條件。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

供試紅花檵木為多年生扦插苗，種植于湖南工業(yè)大學校園內(nèi)；植物多糖多酚總RNA 提取試劑盒，購自北京艾德萊生物科技有限公司；PrimeSTAR GXL DNA 高保真酶和M-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，購自寶日醫(yī)生物技術有限公司。

2.2 RNA 提取和第一鏈cDNA 合成

利用植物多糖多酚總RNA 提取試劑盒，按照試劑盒上的提取方法提取紅花檵木葉片（50～100 mg/次）的總RNA，并以總RNA 為模板，利用Oligo dT18引物及M-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，在42 ℃下延伸1 h 合成第一鏈cDNA，并置于-20 ℃冰箱備用。

2.3 LcCHS1 和LcCHS2 基因克隆

基于已經(jīng)完成的紅花檵木轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，利用其注釋數(shù)據(jù)從中篩選到兩個查爾酮合成酶CHS 同源基因序列，分別命名為LcCHS1 和LcCHS2。這兩個基因的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果序列中都包含了完整的開放閱讀框（ORF），其中LcCHS1 基因的ORF為1 170 bp，LcCHS2 基因的ORF 為1 182 bp。利用Primer Premier 5.0 軟件分別設計LcCHS1 和LcCHS2 基因ORFs 序列上、下游特異引物CHS1-F（5’-GCACCTCATTTCTCTCTTCT-3’）、CHS1-R（5’-TTTTGACTTTCCGACAGCCT-3’）、CHS2-F（5’-AGAAGATAAAGAGAGTGAAGCAG-3’）和CHS2-R（5’-TCATGAACTAATAATGAGCCATG AC-3’），以第一鏈cDNA 為模板，利用高保真酶擴增LcCHS1 和LcCHS2 的cDNAs 片段。PCR 體系為25 μL，擴增程序為：預變性95℃ 2 min；98℃ 10 s，55℃ 15 s，68℃ 90 s，進行35 個循環(huán)；72℃延伸5 min，10 ℃保存。PCR 產(chǎn)物送測序公司進行第一代測序反應，以確定LcCHS1 和LcCHS2 基因的編碼框。

2.4 生物信息學分析

利用DNAMAN 軟件對LcCHS1 和LcCHS2 基因的ORFs 及編碼氨基酸序列進行分析，獲得基因的核苷酸及氨基酸對應表；采用NCBI-BLASTP（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi） 對2 個LcCHSs 同源序列進行搜索，獲得氨基酸的同源序列，利用DNAMAN 軟件對LcCHSs 與其他植物CHS 同源氨基酸序列進行多序列比對，并分析氨基酸序列中的催化位點及關鍵結(jié)構(gòu)域；利用MEGA6 軟件和鄰接法（neighbor-joining method）進行LcCHSs 與多種雙子葉及單子葉植物CHS 同源氨基酸的系統(tǒng)進化樹構(gòu)建；利用SWISS-MODEL 在線網(wǎng)站（https://swissmodel.expasy.org/）對LcCHSs 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)進行建模，并對2 個同源蛋白的結(jié)構(gòu)相似性進行分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 LcCHS1 和LcCHS2 基因序列分析

以紅花檵木的cDNA 為模板，CHS1-F 和CHS1-R 為引物進行PCR 擴增反應擴增LcCHS1 基因的cDNA 序列，CHS2-F 和CHS2-R 為引物擴增LcCHS2 基因的cDNA 序列，產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，LcCHS1 和LcCHS2 的cDNAs 產(chǎn)物大小分別為1 357 bp 和1 242 bp（圖1，其中，M，Marker；帶1，LcCHS1 cDNA 的PCR 產(chǎn)物；帶2，LcCHS2 cDNA 的PCR 產(chǎn)物），且cDNAs 片段均包含了完整的ORFs 序列。圖2為LcCHSs 基因的核苷酸序列及其推導氨基酸序列圖。

圖1 LcCHS1 和LcCHS2 基因的PCR 擴增圖Fig.1 PCR amplification picture of LcCHS1 and LcCHS2 genes

圖2 LcCHSs 基因的核苷酸序列及其推導氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequence with its deduced amino acid sequence of LcCHSs gene

對LcCHS1 和LcCHS2 基因的ORFs 序列進行分析表明，LcCHS1 的ORF 全長為1 170 bp，編碼389個氨基酸（圖2a）；LcCHS2 的ORF 全長為1 182 bp，編碼393 個氨基酸（圖2b）。

3.2 同源性比對及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

利用DNAMAN 軟件， 將紅花檵木LcCHS1和LcCHS2 的氨基酸序列與其他植物CHSs 進行氨基酸多序列比對，結(jié)果如圖3所示。其中，三角形標記處代表三元催化殘基“Cys164、His303 和Asn336”；方框代表CHS 功能活性部位“RLMMYQQGCFAGGTVLR”和CHS 家族特征序列“GVLFGFGPGL”。

圖3 LcCHSs 與其他植物CHSs 氨基酸多序列比對Fig.3 Multiple alignment analysis of LcCHSs with other plant CHSs

紅花檵木LcCHS1 和LcCHS2 之間的氨基酸序列一致性為89.3%。同時，紅花檵木LcCHS1和LcCHS2 與多種植物CHSs 氨基酸序列具有非常高的序列一致性，LcCHS1 和LcCHS2 與茶樹CsCHS2（Camellia sinensis，XP_028080516.1）、葡萄VvCHS（Vitis vinifera，AEP17003.1）、擬南芥AtCHS（Arabidopsis thaliana，AAB35812.1）、煙草NtCHS（Nicotiana tabacum，NP_001312634.1）氨基酸序列一致性均超過83%。將氨基酸序列與以前的研究結(jié)果[16]進行比較分析，表明在LcCHS1和LcCHS2 的氨基酸序列中，參與催化的3 個殘基（Cys164、His303 和Asn336）嚴格保守。同時，2 個LcCHSs 均包含有保守的CHS 酶功能活性位點“RLMMYQQGCFAGGTVLR”（156～172）和CHS酶特征序列“GVLFGFGPGL”（368～377）。

利用MEGA6 和鄰接法，并將bootstrap 設置為1 000 次重復，對LcCHSs 和多種雙子葉植物以及單子葉植物的CHSs 蛋白進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建，具體包括茶樹CsCHS2、葡萄VvCHS、擬南芥AtCHS、煙草NtCHS、核桃JsCHS（Juglans sigillata，ASU91339.1）、榴蓮DzCHS1（Durio zibethinus，XP_022721946.1）、毛果楊PtCHS1（Populus trichocarpa，XP_002303821.2）、矮牽牛PhCHS-A（Petunia hybrida，P08894.1）、牡丹PsCHS（Paeonia suffruticosa，AEK70333.1）、芍藥PlCHS（Paeonia lactiflora，AEK70334.1）、玉米ZmCHS（Zea mays，NP_001142246）、水稻OsCHS（Oryza sativa，BAB39764.1）、小麥TaCHS（Triticum aestivum，AAQ19321.1）。如圖4所示，2 個LcCHSs 在系統(tǒng)進化上與雙子葉植物CHSs 蛋白的親緣關系較近，與單子葉植物的CHSs 蛋白的親緣關系較遠。其中紅花檵木的LcCHS1 蛋白與來源于茶樹和葡萄的CHSs 蛋白的親緣關系較近，LcCHS2 蛋白與來源于牡丹和芍藥的CHSs 蛋白的親緣關系較近。

圖4 LcCHSs 系統(tǒng)進化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of LcCHSs

3.3 LcCHSs 蛋白三級結(jié)構(gòu)預測

利用SWISS-MODEL 在線軟件對紅花檵木的LcCHS1 和LcCHS2 蛋白進行三級結(jié)構(gòu)預測，以擬南芥AtCHS蛋白的晶體結(jié)構(gòu)為模型，進行紅花檵木LcCHSs 的三級結(jié)構(gòu)建模，結(jié)果如圖5所示。

圖5 LcCHSs 蛋白三級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果Fig.5 Tertiary structure prediction of LcCHSs protein

LcCHS1 能夠形成同源二聚體，且預測的催化活性部位位于二聚體的外側(cè)（圖5），LcCHS2 蛋白也形成同源二聚體形式。LcCHS1 蛋白單體與LcCHS2蛋白單體的三級結(jié)構(gòu)高度相似，其多肽鏈空間結(jié)構(gòu)高度重疊，表明2 個LcCHSs 蛋白功能的保守性。

4 試驗結(jié)果討論

CHS 是類黃酮生物合成途徑的第一個限速酶，其活性影響著多種類黃酮物質(zhì)的生物合成，因此CHS 基因?qū)τ谥参锘ㄉ纬?、植物生長發(fā)育及抗性形成都會產(chǎn)生影響[6-10,17]。利用自然或轉(zhuǎn)基因材料研究，已證實了來源于矮牽牛、大麗花、蘋果、獼猴桃等植物的CHSs 在花青苷物質(zhì)的合成過程中有重要的作用[6-15]。CHS 基因表達變化會影響類黃酮物質(zhì)的合成，從而改變植物細胞對生長素的轉(zhuǎn)運能力、影響植株的生長發(fā)育及對生長素類除草劑的抗性[9-10,18]，影響了細胞的擴張[19]及木本植物中木質(zhì)部的形成[20]。CHS 基因還參與了植物對非生物脅迫抗性的建立，例如紫莖澤蘭的EaCHS1 參與抗鹽性的形成[21]，桑葚的CHS 基因參與耐鹽、耐熱及耐旱性的形成[22]。

本研究克隆了2 個紅花檵木LcCHSs 基因，分別編碼389 和393 個氨基酸，2 個LcCHSs 氨基酸序列一致性非常高，達89%。2 個LcCHSs 的氨基酸長度與多種植物的CHSs 相近，例如茶樹CsCHS2（389 個氨基酸）、葡萄VvCHS（389 個氨基酸）、煙草NtCHS（389 個氨基酸）、擬南芥AtCHS（395 個氨基酸），且氨基酸序列一致性均超過83%。同時，氨基酸序列中參與催化的3 個殘基（Cys164、His303 和Asn336）、兩段CHS 重要序列“RLMMYQQGCFAGGTVLR”（156～172）和“GVLFGFGPGL”（368～377） 都在兩個LcCHSs中高度保守，這表明了兩個LcCHSs 功能的保守性。在之前的研究中，已經(jīng)有LcvrCHS1 蛋白的報道（GenBank：AFG25049.1），其氨基酸全長為232，該蛋白缺乏CHS 的特征序列“GVLFGFGPGL”，經(jīng)過序列比對，證實LcvrCHS1 為本文LcCHS1（389個氨基酸）的部分序列，這可能是由于利用RACE技術進行LcvrCHS1 的cDNA 擴增時沒有完全擴增到兩端，或者是由于mRNA 發(fā)生了可變剪切，造成了編碼框的改變。

系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果表明，紅花檵木兩個LcCHSs 分別與不同植物CHSs 的親緣關系較近，但考慮到兩者之間氨基酸序列的一致性很高，且通過三級結(jié)構(gòu)建模也證實了兩者蛋白空間結(jié)構(gòu)非常相似，推測LcCHS1 和LcCHS2 蛋白可能存在功能冗余。但兩個LcCHSs 在紅花檵木花青苷生物合成的功能還需要進一步研究，特別是基因的時空表達及響應環(huán)境的表達差異。在植物中，CHS 基因的表達受到多種內(nèi)、外在因子的誘導，例如JA（jasmonic acid）、ABA（abscisic acid）、SA（salicylic acid）、紫外線B、干旱、低溫等[21-27]，這是由于類黃酮在植物響應并抵御生物或非生物脅迫中起重要作用，而作為類黃酮生物合成的第一個關鍵酶往往會被快速誘導表達。同時，為了能更好地了解LcCHS1 和LcCHS2的功能，還需要對基因的體內(nèi)調(diào)控機制開展研究，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和翻譯后調(diào)控，例如海棠中的轉(zhuǎn)錄因子McMYB4/5 可能參與McCHS 的活性轉(zhuǎn)錄調(diào)控[13]，矮牽牛和大麗花的小RNAs 介導了PhCHS-A 和DvCHS2 的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[6,8]，而蛋白水解酶KFBCHS 調(diào)控CHS 蛋白質(zhì)翻譯后的降解進程[28]。通過對LcCHS1 和LcCHS2 響應內(nèi)外因子的表達特征分析、以及體內(nèi)分子調(diào)控機制的研究，將能夠更好地了解這兩個LcCHSs 基因在紅花檵木葉色形成、響應環(huán)境變化及生長發(fā)育中的作用。