邵 帥,江 梅,姜經(jīng)航,曹玉平，王開秀，蔡麗麗，王婷婷，杜家成，王 洋，洪樂鵬，丁 濤

0 引 言

順鉑是臨床最常用的抗癌藥物之一。順鉑廣泛用于治療頸部、膀胱和子宮頸等部位的惡性腫瘤，通過與DNA結(jié)合來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞生長(zhǎng)[1]。順鉑具有顯著的抗癌活性，但也有耳毒性、腎毒性、神經(jīng)毒性、睪丸毒性等不良反應(yīng)[2]。順鉑也廣泛用于男性生殖系統(tǒng)腫瘤的治療，提高治愈率的同時(shí)對(duì)男性生殖系統(tǒng)有明顯毒副作用，能夠?qū)е律?xì)胞凋亡、精子損傷以及精子畸形等，從而影響男性生育力[3]。目前, 順鉑導(dǎo)致睪丸生殖毒性的機(jī)制尚不明確, 研究顯示氧化應(yīng)激在順鉑引起的睪丸損傷中發(fā)揮著重要的作用，順鉑能夠破壞睪丸組織內(nèi)抗氧化系統(tǒng)，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物丙二醛以及活性氧ROS表達(dá)升高，抑制抗氧化酶超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione Peroxidase,GPx)、還原性谷胱甘肽(glutathione，GSH)，從而導(dǎo)致精子損傷和凋亡[4]。因此，抗氧化應(yīng)激能夠保護(hù)順鉑誘導(dǎo)的睪丸毒性損傷。

褪黑素是由松果腺合成和分泌的神經(jīng)內(nèi)分泌激素, 具有調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等作用[5]。褪黑素是一種天然抗氧化劑，能夠直接清除多種自由基并且可以激活多種抗氧化酶[6]；研究顯示在雙氯芬酸鈉誘導(dǎo)的生殖毒性損傷中，褪黑素可以通過提高抗氧化酶SOD、總抗氧化能力(total antioxidant capacity,TAC)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)，降低乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase ,LDH)、丙二醛、尿酸以及C反應(yīng)蛋白(C-reactionprotein，CRP)的表達(dá)發(fā)揮保護(hù)作用[7]。此外，褪黑素受體存在人類精子中段上，而且褪黑素與精子活力、受精以及精子的活力和形態(tài)有關(guān)[8]。目前男性生殖毒副作用的研究主要集中在睪丸，Sertoli細(xì)胞，又稱支持細(xì)胞，存在于睪丸生精上皮中, 其在精子發(fā)育有重要影響。Sertoli細(xì)胞形態(tài)和功能的改變以及深層次的分子學(xué)研究已成為男性生殖領(lǐng)域最關(guān)注的熱點(diǎn)[9]。鑒于順鉑導(dǎo)致的睪丸毒性損傷以及褪黑素在精子中抗氧化保護(hù)作用，本研究主要研究褪黑素對(duì)順鉑誘導(dǎo)氧化損傷的保護(hù)作用以及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料TM4細(xì)胞由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院惠贈(zèng)。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、0.25%胰蛋白酶均購(gòu)于美國(guó)GIBCO公司，褪黑素購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，順鉑購(gòu)于齊魯制藥有限公司，噻唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Abcam公司，丙二醛、CAT、GSH以及SOD檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所，occludin、N-cadherin抗體均購(gòu)自Santa Cruz公司，緊密連接蛋白1(ZO-1)、β-catenin 、Nrf2/ARE通路核因子E2相關(guān)因子2((NF-E2-related factor 2，Nrf2)、血紅素加氧酶1(Heme oxygenase，HO-1)、醌氧化還原酶(Quinone dehydrogenase1，NQO1)抗體均購(gòu)于Abcam公司，β-acting、HRP-山羊抗兔購(gòu)于中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1 TM4細(xì)胞培養(yǎng)TM4細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和1%青霉素、鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液中，將細(xì)胞置于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)生長(zhǎng)，24 h進(jìn)行換液，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行傳代和實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞分組及處理將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的TM4細(xì)胞用胰蛋白酶消化，以1×105/ mL接種于6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，每孔加入2 mL培養(yǎng)液。將細(xì)胞分為對(duì)照組(給予等量等滲鹽水)、順鉑組(添加 0.014 mg/mol的順鉑孵育24 h建立損傷模型)、順鉑+褪黑素組(順鉑處理前0.5 h添加1 mmol/L的褪黑素預(yù)處理)、褪黑素組(添加1 mmol/L的褪黑素孵育)。

1.2.3MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率將TM4細(xì)胞以1×104/100 μL接種于96孔板中，分組如上，按照1.2.2中的藥物處理，每組6個(gè)重復(fù)。空白組只加培養(yǎng)液，96孔板周圍一圈用滅菌PBS代替。培養(yǎng)24h后去除舊的培養(yǎng)液，并加入180 μL的新鮮培養(yǎng)液，再加入20 μL MTT溶液(5 μg/mL)，培養(yǎng)4 h后加入DMSO 150 μL振蕩至藍(lán)紫色結(jié)晶溶解，最后酶標(biāo)儀檢測(cè)A值。細(xì)胞存活率計(jì)算如下：

細(xì)胞存活率=1-(用藥組平均A值-空白組平均A值)/(對(duì)照組平均A值-空白組平均A值)×100%

1.2.4丙二醛、SOD、GSH、SOD活性檢測(cè)TM4細(xì)胞按1.2.2中以1×105/ mL接種于6孔板中培養(yǎng)和處理細(xì)胞后，0.25%胰蛋白酶消化處理后收集TM4細(xì)胞，將細(xì)胞洗滌后加入裂解液(含PMSF)重懸細(xì)胞，放在冰塊上裂解15 min，離心機(jī)中按4 ℃，12 000 r/min 離心 10 min，然后收集EP管中離心后上清液。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)丙二醛、SOD、GSH以及CAT的含量活性。

1.2.5Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)TM4細(xì)胞按1.2.2中以1×105/ mL接種于6孔板中培養(yǎng)，處理細(xì)胞后提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)各組蛋白濃度，并調(diào)平各組蛋白濃度，各組取40 μg蛋白樣品于聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后275 mA 電流2 h將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，然后用5%脫脂奶粉封閉2 h后，PBST清洗后加入一抗ZO-1、Occludin、β-catenin、Nrf2、HO-1、NQO1(各抗體濃度均為1∶1000)，4 ℃冰箱孵育過夜；第2天恢復(fù)室溫PBST清洗后，加入HRP-山羊抗兔抗體室溫孵育2 h，PBST清洗后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影。

2 結(jié) 果

2.1褪黑素對(duì)順鉑誘導(dǎo)的TM4細(xì)胞增殖的影響MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，順鉑組能夠明顯抑制TM4細(xì)胞的增殖(P<0.01)；順鉑+褪黑素組明顯改善順鉑對(duì)TM4細(xì)胞的抑制作用(P<0.01)。見圖1。

2.2褪黑素對(duì)cDDP誘導(dǎo)的TM4細(xì)胞內(nèi)抗氧化指標(biāo)的影響活力檢測(cè)結(jié)果顯示，順鉑組丙二醛活力表達(dá)較對(duì)照組明顯升高，較順鉑+褪黑素組明顯降低，SOD、GSH、CAT活力表達(dá)較對(duì)照組、順鉑+褪黑素組明顯下降(P<0.01)。褪黑素組SOD、CAT表達(dá)較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)。見表1。

與對(duì)照組比較,*P<0.01;與順鉑組比較,#P<0.01

表 1 褪黑素對(duì)順鉑誘導(dǎo)的TM4細(xì)胞內(nèi)抗氧化指標(biāo)的影響

2.3褪黑素對(duì)順鉑誘導(dǎo)的血睪屏障的影響Western blot結(jié)果顯示，順鉑+褪黑素組、對(duì)照組ZO-1、Occludin 蛋白表達(dá)較順鉑組明顯升高(P<0.01)，β-catenin蛋白較順鉑組明顯降低(P<0.01)；順鉑+褪黑素組ZO-1、Occludin 蛋白表達(dá)較褪黑素組明顯降低(P<0.01)。見圖2，表1。

1:對(duì)照組; 2:順鉑組; 3:順鉑+褪黑素組; 4:褪黑素組

表 2 褪黑素對(duì)順鉑誘導(dǎo)的血睪屏障的影響

2.4褪黑素對(duì)順鉑誘導(dǎo)的Nrf2/ARE信號(hào)通路的影響Western blot結(jié)果顯示，順鉑組中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯下降(P<0.01)；順鉑+褪黑素組Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)較順鉑組明顯升高(P<0.01)，HO-1、NQO1表達(dá)較褪黑素組明顯降低(P<0.01)。見圖3，表3。

1:對(duì)照組; 2:順鉑組; 3:順鉑+褪黑素組; 4:褪黑素組

表 3 褪黑素對(duì)Nrf2/ARE信號(hào)通路的影響

3 討 論

順鉑作為臨床抗腫瘤的一線用藥，不管是用于生殖系統(tǒng)腫瘤，還是應(yīng)用于肺癌、胃癌、食管癌等腫瘤，都會(huì)直接或者間接的導(dǎo)致睪丸毒性[10-12]。研究顯示氧化應(yīng)激損傷是順鉑誘導(dǎo)的睪丸損傷的重要機(jī)制，在順鉑誘導(dǎo)的大鼠睪丸損傷模型中MDA、8-OHdG和MPO水平升高，而抗氧化酶GSH 和SOD水平降低，導(dǎo)致精子數(shù)量、增殖指數(shù)減少，輸精管萎縮、細(xì)胞間緊密連接功能退化[13]。主要由于順鉑引起睪丸組織內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡，抗氧化能力減弱產(chǎn)生大量的ROS，大量的ROS使生精細(xì)胞與精原干細(xì)胞大量凋亡,、曲細(xì)精管空隙擴(kuò)大，影響精子發(fā)生最終導(dǎo)致精子的數(shù)量與質(zhì)量的降低, 并影響雄性正常生育功能[14]。褪黑素作為一種新型高效抗氧化劑和自由基清除劑，能保護(hù)細(xì)胞核DNA、膜脂質(zhì)等分子免受氧化損傷，并且與男性生殖系統(tǒng)以及精子保護(hù)有著重要的作用[15]。鑒于此，本研究以小鼠睪丸支持細(xì)胞TM4為研究對(duì)象，H2O2刺激TM4細(xì)胞誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷模型，探討褪黑素發(fā)揮抗氧化保護(hù)作用以及可能機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，順鉑誘導(dǎo)能夠降低細(xì)胞存活率，這與杜月梅等[16]研究顯示順鉑誘導(dǎo)小鼠睪丸支持細(xì)胞TM4細(xì)胞凋亡的結(jié)果一致。在順鉑誘導(dǎo)的損傷模型中脂質(zhì)過氧化物MDA明顯升高，抗氧化酶SOD、GSH、CAT表達(dá)明顯下降，說明順鉑在誘導(dǎo)支持細(xì)胞損傷中產(chǎn)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致氧化與抗氧化之間平衡失調(diào)，產(chǎn)生高反應(yīng)醛類物質(zhì)，這些親電物質(zhì)能夠使參與精子生物能量通路以及運(yùn)動(dòng)裝置結(jié)構(gòu)和信號(hào)元件的蛋白質(zhì)失調(diào)，從而對(duì)精子運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生不利的影響，這些損傷與氧化性DNA損傷密切相關(guān)[17]；而褪黑素能夠抑制順鉑的毒副作用，促進(jìn)細(xì)胞存活率發(fā)揮保護(hù)作用，褪黑素能夠發(fā)揮抗氧化作用，促進(jìn)抗氧化酶SOD、GSH、CAT的表達(dá)，降低MDA表達(dá)，抑制順鉑誘導(dǎo)的氧化損傷作用；而Li等[18]研究也發(fā)現(xiàn)褪黑素可以通過MAPK-ERK信號(hào)通路保護(hù)心肌細(xì)胞免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡，說明褪黑素可以通過抗氧化發(fā)揮TM4細(xì)胞保護(hù)作用，這與抗氧化劑維生素C通過減輕氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)HSP在MT4細(xì)胞上表達(dá)減輕熱損傷效應(yīng)相一致[19]。睪丸中生精小管和血液之間存在著血睪屏障，它是支持細(xì)胞之間的緊密連接、縫隙連接、粘附連接以及橋粒組成，血睪屏障不僅為生殖細(xì)胞發(fā)育和運(yùn)動(dòng)創(chuàng)造了有利的微環(huán)境，而且還創(chuàng)建了一個(gè)免疫屏障, 確保免疫系統(tǒng)不能識(shí)別存在于生殖細(xì)胞表面的特異性抗原[20]，因此，血睪屏障在精子發(fā)生、形成和成熟過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，而順鉑誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是否會(huì)損傷血睪屏障尚不可知，通過Western Blot結(jié)果顯示睪丸中緊密連接蛋白ZO-1和occludin表達(dá)降低，睪丸中粘附連接蛋白β-catenin表達(dá)升高，而Liu等[21]研究也顯示PM2.5通過TGF-β3/p38 MAPK以及減少睪酮分泌、睪丸緊密連接蛋白Occludin, Claudin-11表達(dá)降低導(dǎo)致血睪屏障損傷的結(jié)果一致；DEHP暴露能夠損傷血睪屏障導(dǎo)致睪丸組織中粘附連接蛋白N-cadherin和β-catenin的表達(dá)增加；說明順鉑誘導(dǎo)的睪丸毒性對(duì)血睪屏障有明顯的損傷作用，其機(jī)制可能與氧化應(yīng)激有關(guān)[22]。然而順鉑誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷仍不明確，研究顯示二甲雙胍在脊髓損傷后神經(jīng)再生中的作用可能與抑制akt介導(dǎo)的Nrf2/ARE通路調(diào)控的氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙有關(guān)[23]；姜黃素類似物A13通過激活Nrf2/ARE通路緩解氧化應(yīng)激，改善高脂飲食和鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠心肌纖維化[24]。因此，我門猜想褪黑素發(fā)揮抗氧化保護(hù)作用是否與Nrf2/ARE通路信號(hào)通路有關(guān)。本研究結(jié)果顯示順鉑組中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)明顯下降，而添加褪黑素褪黑素能明顯改善順鉑對(duì)Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)抑制作用，促進(jìn)其蛋白表達(dá)；說明褪黑素發(fā)揮抗氧化保護(hù)作用與Nrf2/ARE信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)褪黑素在順鉑誘導(dǎo)的損傷模型中抑制氧化應(yīng)激，發(fā)揮抗氧化以及血睪屏障保護(hù)作用，促進(jìn)細(xì)胞的存活，其可能的機(jī)制與Nrf2/ARE信號(hào)通路有關(guān)，但具體機(jī)制有待深入研究。