余 暉，宋輝瓊，程江霞，彭曉紅

0 引 言

對腎癌患者來說，腎切除術(shù)仍然是局部腎癌的重要干預(yù)措施，但對于術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性腎癌患者，系統(tǒng)治療和個性化靶向治療是主要的治療手段[1-2]。

研究發(fā)現(xiàn)，局部麻醉藥物普魯卡因(procaine，PCA)在肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等多種癌中取得了一定的療效，其可終止細胞的有絲分裂，從而抑制腫瘤細胞的增長[3]。但其對腎癌細胞生物學(xué)行為的影響目前還未有研究。研究發(fā)現(xiàn)性別決定區(qū)Y-box蛋白2(Sex-determining region Y-box protein，SOX2)在人腎癌組織中的表達升高，是腎透明細胞癌患者預(yù)后的預(yù)測指標，與預(yù)后不良相關(guān)[4]。本研究假設(shè)PCA可能通過調(diào)控SOX2抑制腎癌，以人腎透明細胞腺癌細胞786-O 細胞為研究對象，以不同濃度PCA處理細胞檢測其對786-O 細胞增殖、凋亡的影響及SOX2在此過程的作用，探尋PCA對腎癌的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料人腎透明細胞腺癌細胞系786-O、腎上皮細胞HEK293購自美國ATCC； PCA購自上海源葉生物科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司，胰蛋白酶、四氮唑藍(MTT)和二甲基亞礬(DMSO)購自北京索萊寶科技有限公司；SOX2抑制物(si-SOX2)、SOX2過表達載體(pcDNA3.1-SOX2)和陰性對照(si-NC、pcDNA3.1)購自上海吉瑪制藥有限公司；SOX2抗體、Cyclin D1抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體和抗GAPDH抗體購自英國Abcam公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；雙染色流式法細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；流式細胞儀購自美國BD公司，全自動酶標儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和藥物處理細胞培養(yǎng)：將786-O細胞、HEK293細胞培養(yǎng)于含10 % FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加1% 青霉素和1% 鏈霉素，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用胰蛋白酶消化傳代。藥物處理：將100 mg PCA溶于2 mL無水乙醇，無菌水定容至10 mL，即為10 mg/mL的PCA，經(jīng)過濾除菌分裝后凍存。將PCA以終濃度 1、5、10 mmol/L加入RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)786-O細胞、HEK293細胞。收集各組細胞，在培養(yǎng)24、48和72 h時，進行MTT實驗，酶標儀測定A490nm值。結(jié)果表明，PCA低、中、高濃度組786-O 細胞隨PCA濃度升高A490值降低，細胞凋亡率升高，Cyclin D1和Bcl-2表達量降低，Bax表達量升高，培養(yǎng)時間48 h。與對照相比，5 mmol/L PCA 786-O細胞中SOX2表達量顯著降低(P<0.05)。說明5 mmol/L PCA可抑制786-O細胞中SOX2表達，選用5 mmol/L PCA進行后續(xù)實驗。

1.2.2細胞轉(zhuǎn)染待786-O細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，按照Lipofectamine 2000說明書進行細胞轉(zhuǎn)染。先用無血清OptiMEM培養(yǎng)液稀釋Lipofectamine 2000、SOX2干擾對照質(zhì)粒(si-NC)、SOX2干擾質(zhì)粒(si-SOX2)，然后將等體積脂質(zhì)體、載體或片段混合，室溫孵育20 min，然后加入到培養(yǎng)好的786-O 細胞中，混合均勻，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)6 h后換成RPMI-1640完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，分別記為si-NC組和si-SOX2組。

將SOX2過表達對照質(zhì)粒(pcDNA3.1)和SOX2過表達質(zhì)粒(pcDNA3.1-SOX2)按上述方法轉(zhuǎn)染至786-O 細胞中，6 h后用含5 mmol/L PCA的RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h，分別記為PCA-M+pcDNA3.1組和PCA-M+pcDNA3.1-SOX2組。

1.2.3流式細胞術(shù)測定細胞凋亡率將各組細胞，用無 EDTA 的0.25%的胰蛋白酶消化，用PBS緩沖液洗滌2次，收集細胞，根據(jù) Annexin V/PI 試劑盒說明書進行操作，先加 300 μL Binding buffer重懸細胞，再加入5 μL Annexin V-FITC混勻，避光室溫孵育20 min，再加入5 μL 碘化丙啶(PI)和200 μL Binding buffer，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4Western blot檢測收集各組786-O細胞，加入RIPA裂解液重懸細胞，超聲破碎后離心收集蛋白，測定總蛋白濃度。將收集的蛋白樣本進行SDS-PAGE，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入稀釋的一抗(SOX2抗體1∶1000、Cyclin D1抗體1∶2000、Bax抗體1∶3000、Bcl-2抗體1∶3000和GAPDH抗體1∶4000)，4 ℃孵育過夜，用TBST緩沖液洗膜3次，加入稀釋的酶標二抗室溫孵育1 h，顯影后掃描，以GAPDH 為內(nèi)參照，分析蛋白表達水平。

2 結(jié) 果

2.1 抑制SOX2對細胞786-O增殖、凋亡的影響與si-NC組相比，si-SOX2組786-O細胞中SOX2、Cyclin D1和Bcl-2 表達量顯著降低(P<0.05)，Bax表達升高(P<0.05)，細胞A490值在24、48和72 h均顯著降低(P<0.05)，si-SOX2組細胞凋亡率[(22.20±2.23)%]較si-NC組[(7.35±0.74)%]顯著升高(P<0.05)，見圖1、圖2，表1。表明抑制SOX2可抑制786-O 細胞增殖并促進細胞凋亡。

a：si-NC組； b：si-SOX2組

1：si-NC組； 2：si-SOX2組

表 1 抑制SOX2對786-O細胞活性、凋亡和786-O增殖、凋亡蛋白表達影響

2.2過表達SOX2能逆轉(zhuǎn)PCA對細胞786-O增殖的抑制作用與對照組相比，PCA組786-O 細胞中SOX2和CyclinD1表達量顯著降低(P<0.05)，p21蛋白表達量顯著升高(P<0.05)，細胞A490值在24、48和72 h均顯著降低(P<0.05)；與PCA-M+pcDNA3.1組相比，PCA-M+pcDNA3.1-SOX2組786-O 細胞中SOX2和CyclinD1含量顯著升高(P<0.05)，細胞A490值在24、48和72 h均顯著升高(P<0.05)。見圖3，表2。說明過表達SOX2可逆轉(zhuǎn)PCA對786-O 細胞的增殖抑制作用。

2.3過表達SOX2能逆轉(zhuǎn)PCA對細胞786-O凋亡的促進作用與對照組相比，PCA組786-O 細胞中Bcl-2表達量顯著降低(P<0.05)，Bax蛋白表達量顯著升高(P<0.05)，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與PCA +pcDNA3.1組相比，PCA+pcDNA3.1-SOX2組786-O 細胞中Bcl-2表達量顯著升高(P<0.05)，Bax蛋白表達量顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖4、圖5，表3。說明過表達SOX2可逆轉(zhuǎn)PCA對786-O 細胞凋亡的促進作用。

1:對照組; 2:PCA組; 3:PCA +pcDNA3.1組; 4:PCA+pcDNA3.1-SOX2組

表 2 過表達SOX2能逆轉(zhuǎn)PCA對細胞786-O增殖的抑制作用

a:對照組; b:PCA組; c:PCA +pcDNA3.1組; d:PCA+pcDNA3.1-SOX2組

1:對照組; 2:PCA組; 3:PCA +pcDNA3.1組; 4:PCA+pcDNA3.1-SOX2組

表 3 過表達SOX2能逆轉(zhuǎn)PCA對細胞786-O凋亡的促進作用

3 討 論

眾多研究證實，PCA對胃癌、骨肉瘤、結(jié)腸癌和肺癌有顯著的抑制作用，但其對腎癌是否也具有抑制作用尚不清楚[5-8]。本研究分別用1、5、10 mmol/L的PCA處理腎癌786-O 細胞和正常腎上皮細胞HEK293，結(jié)果表明3種濃度的PCA均可抑制腎癌786-O 細胞增殖并促進細胞凋亡，使增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1表達下調(diào)，凋亡相關(guān)蛋白Bax表達上調(diào)而Bcl-2表達下調(diào)，說明PCA對腎癌具有潛在的臨床抑制作用，但其具體作用機制尚不清楚，后續(xù)實驗選擇對786-O 細胞抑制率約50%的5 mmol/L濃度的PCA，但對正常腎上皮細胞HEK293無顯著影響。

性別決定區(qū)Y-box蛋白2(Sex-determining region Y-box protein，SOX2)是SOX家族成員之一，SOX(SRY-like HMG box)家族是一類具有 HMG(high mobility group)特征性結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子家族。轉(zhuǎn)錄因子SOX2在胚胎發(fā)生過程中必不可少，研究表明其在至少25種不同的癌癥中都有表達，與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、耐藥性和生存率的增加有直接關(guān)系，針對SOX2的表達或其作用方式可以提高某些難以治療的癌癥患者的存活率[9]。SOX2是誘導(dǎo)多功能干細胞形成的重要因素，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、成體組織的穩(wěn)態(tài)和衰老過程中也有重要作用[10]。SOX2在乳腺癌組織中高表達，與病理學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)[11]。在II期胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)患者(均接受吉西他濱治療)中，SOX2蛋白的高表達與吉西他濱耐藥性、腫瘤復(fù)發(fā)和低生存率有關(guān)[12]。研究表明，SOX2在腎透明細胞癌(RCC)患者中高表達，是RCC患者預(yù)后的預(yù)測指標，SOX2高表達與預(yù)后不良相關(guān)[13]。下調(diào)SOX2可抑制RCC增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細胞凋亡[14]。因此，本研究假設(shè)PCA可能通過調(diào)控SOX2抑制腎癌細胞的增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，PCA處理后786-O 細胞中SOX2表達量顯著下降，抑制SOX2可抑制786-O 細胞增殖并促進細胞凋亡；過表達SOX2可逆轉(zhuǎn)PCA對786-O 細胞的增殖和凋亡的作用，說明PCA是通過抑制SOX2表達來抑制786-O 細胞增殖并促進細胞凋亡。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，PCA可通過抑制SOX2表達抑制腎癌786-O 細胞增殖和促進凋亡，PCA對腎癌具有潛在的抑制作用。

本研究存在一定的局限性，只進行了PCA對一種體外腎癌細胞的實驗，后續(xù)將補充PCA對多種腎癌細胞及動物體內(nèi)成瘤模型的作用，為PCA對腎癌的臨床應(yīng)用提供更可靠的實驗數(shù)據(jù)支持。